بخشی از مقاله
چکیده:
استفاده از تکنولوژیهای نسل بعدی توالییابی، امکان توالییابی مجدد کل ژنوم گیاهان و یا کل ترنسکریپتوم نمونه را به گونهای کارامدتر، اقتصادیتر و دقیقتر از قبل فراهم آورده است. توالییابی RNA یا RNA-seq روشی برای دستهبندی ترنسکریپتوم است، که در آن سطوح بیان ژنهای خاص، اسپلایسینگ افتراقی1، و بیان آللهای خاص در رونوشتها، بهدقت برای بررسی بسیاری از مسائل بیولوژیکی، ارزیابی میگردد. این تکنولوژیها به طور روزافزونی در شناسایی چندشکلیهای تک نوکلئوتیدی - SNP - ، تهیه نقشههای لینکاژی، تعیین ژنهای مقاومت، تعیین QTL ها، تعیین نواحی کروموزومی انتقال یافته به نتاج، توالییابی کل ژنوم و کاربردهای دیگر مورد استفاده قرار میگیرند. درین مقاله با بررسی جنبههای متفاوت تکنولوژیهای NGS به توصیفی کلی از مراحل و کاربردهای آن در کشاورزی و گیاهان زراعی میپردازیم.
مقدمه:
کاربرد NGS در ترانسکریپتومیکس،معمولاً RNA-seq خوانده میشود، که امکان توصیف کامل وقایع رونوشت برداری درون بافت خاص را فراهم میآورد. سودمندی این روش برای گونههای غیر مدل، که اغلب فاقد توالی مرجع هستند، به اثبات رسیده استاساساً. RNA-seq برای دستیابی به اطلاعات مفید ترانسکریپتوم بینیاز از ژنوم مرجع است. NGS قادر به تولید همزمان خوانشهای2 کوتاه 50 تا 800 جفت بازی بوده و سرعت تولید دادههای توالییابی بهروز و حتی به چند ساعت کاهش یافتهاست. هزینه این تکنولوژیها به ازای هر جفت باز DNA، پائین بوده و نیاز به مراحل همسانهسازی ندارد. حجم وسیع دادههای تولیدی، روزنههای جدید زیادی را در رشتههای مختلف علمی بازکرده است. با استفاده از تکنولوژیهای NGS دانش ما در مورد ترانسکریپتوم پیشرفت بسزایی داشته است .
در حالحاضر، RNA-seq، توالییابی ترانسکریپتوم است که با بهرهگیری از تکنولوژیهای NGS، به موضوع متداولی در این زمینه تبدیل شدهاست. روشهای دیگر مطالعه بیان ژن مانند ریزآرایهها و SAGE جای خود را به RNA-seq دادهاند. به دلیل توالییابی دقیق تکنولوژی RNA-seq، این تکنولوژی مجموعهای از توالیهای بیانشده، در یک بافت خاص، در زمان مشخص را نشان میدهد. این روش، شمایی کلی از وقایع رونوشت برداری را در نمونههای زیستی در اختیار قرار میدهد.
دادههای تولیدی قابل تطبیق و استفاده برای توصیف ژنها و طبقهبندی ژنها - - Dassanayake et al. 2009، آشکارسازی اطلاعات رونوشتهای جدید - Denoeud et al. 2008 - ، بررسی بیان ژن و چندشکلی تک نوکلئوتیدی - Novaes et al. 2008 ., Alagna et al. 2009 - 1 - SNP - ، ویرایش جانشینی - Wang et al. 2008 - 2 و تنوع ساختاری - Maher et al. 2009 - ، هستند. تکنولوژی RNA-seq، درزمانی که تأکید توالییابی بر نواحی کدکننده بیشتر از کل ژنوم است و هنگامیکه ابزارهای ژنتیکی و دادههای توالی و یا منابع کم و محدودی در دسترس است، ابزار سودمندی برای گونههای گیاهی غیر مدل است.
- 1 طراحی آزمایشگاهی RNA-seq
1-1 انتخاب نمونه و تیمار
در هر بررسی ترانسکریپتومیکس، انتخاب نمونه از جمله مهمترین مراحل اولیه به شمار میرود. مواد باید بهگونهای انتخاب شوند که دادههای مطابق و مناسب را تولید کنند، که این نیازمند داشتن اطلاعات قبلی قابلتوجه از گونههای موردنظر، تعیین بافت و مرحله رشدی، تیمارها و شاهد مورد استفاده در استخراج RNA، حجم موردنیاز توالییابی و تیمار ابتدایی RNA برای توالییابی است . - Strickler et al. 2012 -
1-2 اطلاعات قبلی گونهها
تغییر در ژنها و تکرار آنها سرهمکردن3 رونوشت را پیچیده میکند. زیرا تشخیصدادن آنها از خطاهای توالییابی، غیریکنواختی4 و دو برابر شدن ژنها سخت میشود. گونههای مدلمعمولاً خودگشن هستند، بنابراین لاینهای هموزیگوس - خالص - بسیاری وجود دارد. اگرچه، گونههای غیر مدل ممکن است دگرگشن باشند، که این خود منجر به افزایش سطح هتروزیگوسیتی میشود. این امر ، تشخیص SNPهای واقعی و خطاهای توالییابی را پیچیده میکند، از این رو شناسایی SNP ها سخت میشود . - Soltis et al . 2009 -
1-3 تیمار و انتخاب بافت
ممکن است بیان متفاوت ژن1 در طی تنش غیرزنده یا پاسخ به پاتوژن مدنظر باشد، قبل از انتخاب بافت باید این تیمارها را اعمال کرد. علاوه بر این، بافت گیاهی مناسب، و مرحله رشدی گیاه نیز در مراحل آزمایشگاهی باید در نظر گرفته شود . - strickler et al. 2012 -
1-4 توالییابی کارآمد
یک آزمایش RNA-seq میتواند برای بهینهسازی میزان و نوع اطلاعات تولیدی طراحی شود. برای مثال، دادههای تولیدی میتواند معرف بیان کلیه ژنهاو یا متناوباً روی زیرمجموعهای از رونوشتها متمرکز شود . - Mamanova et al. 2010 -
1-5 تیمار RNA پس از استخراج
بسته به هدف، کتابخانههای توالییابی، مورد تکثیر یا نرمالسازی قرار میگیرند. نرمالسازی کتابخانههای توالییابی شده، تعداد بیش از اندازه رونوشتها با فراوانی بالا را تنظیم میکند. اگر کتابخانه برای تجزیه بیان ژنها مورد استفاده قرار میگیرد باید از نرمالسازی اجتناب کرد. بااینحال در مطالعات ترانسکریپتوم2 در زمانی که امکان پوشش بیشتر ترانسکریپتومهای موجود وجود داشته باشد نرمالسازی میتواند مفید باشد. بهطور مشابه، در زمانیکه نمونه اولیه کتابخانههای توالییابی کافی نباشد، میتوان آنها را تکثیر کرد. در مطالعات بیانی چون تکثیر میتواند نرخ جمعیت RNA را بر هم زند، و شناسایی بیان متفاوت ژنهای پائیندست را نامعتبر سازد، از بهکارگیری آن باید اجتناب شود . - Ekblom and Galindo. 2011 -
1-6 انتخاب پلت فرم - روش -
در حال حاضر، - Margulies et al. 2005 - Roche/454 و - San Diego, California, USA - Solexa/Illumina دو تکنولوژی اصلی NGS هستند که بهطور موفقیتآمیزی در مطالعات ترانسکریپتومیکس گیاهان غیر مدل مورداستفاده قرارگرفتهاند. هر دو تکنولوژی قادر به توالییابی DNA از هر دو انتهای هستند. ازآنجاکه طول خوانشهای تولیدی در تکنولوژی Solexa/illumine کوتاهتر از خوانشهای تولیدی در Roche/454 است و پوشش عمیقتری - بیشتر - را فراهم میآورد، انجام اسمبلی de novo با استفاده از این روش مشکل است، کهاحتمالاً به دلیل دشواری سرهم- بندی توالیها است. ترانسکریپتوم گیاهان غیر مدل کمتری با استفاده از روش Solexa/Illumina تعیین شدهاند.
