دانلود مقاله ارزیابی سیتوژنتیکی ارقام کلزا و دو گونه وحشی سرده براسیکا

بخشی از مقاله

مقدمه

سرده براسیکا حدود 100 گونه دارد که اغلب آنها بومی نواحی مدیترانهاي هستند. بر اساس تعداد کروموزومهاي هاپلوئید هشت گروه در این سرده شناسایی شدهاند .(26)
این سرده شامل شش گونه زراعی است که سه گونه آن دیپلوئید و سه گونه آن تتراپلوئید هستند. از گونه هاي تتراپلوئید سرده براسیکا در روغنکشی استفاده میگردد.

کلزا مهم ترین گیاه روغنی در این سرده است. کلم وحشی

با نام علمی Brassica oleracea L. یکی از گونههاي سرده براسیکا و بومی اروپاي غربی است. این گیاه داراي ژنهاي مهمی است که ویژگیهاي خوبی از جمله مقاومت به تنشهاي زنده و غیر زنده را کنترل میکنند 1) و .(12 به همین دلیل میتواند منبع ژنتیکی بسیار خوبی براي اصلاح این سرده به خصوص کلزا باشد. کلم وحشی قرابت بسیار زیادي با گونههاي سرده براسیکا دارد و یکی از اجداد کلزا

446

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

محسوب میشود. خردل مدیترانهاي نامهاي متعدد معمول و علمی از جمله B.incana و Hirschfeldia incana دارد.
منشاء آن مدیترانهاي و در اکثر مناطق دنیا پراکنش دارد.

مطالعاتی وجود دارد که نشان میدهد این گیاه میتواند در خود عناصر بسیار سمی به خصوص تالیوم جمع کند. در مطالعهاي که در اسپانیا انجام شده مشخص گردید که این گیاه به همراه چند گونه دیگر براسیکا میتوانند تالیوم موجود در خاك را به داخل خود انتقال و تجمع دهند. در این مطالعه ضریب انتقال تالیوم از خاك به گیاه بسیار بالا بود(.(28 خردل مدیترانهاي تنها گونه Hirschfeldia است که از خویشاوندان اصلی براسیکا بخصوص کلم وحشی محسوب میگردد(.(30

کاتچساید (9) تفاوتهاي ریختی بین کروموزومهاي بدنی B. napus و B. rapa را گزارش نمود. وي مشاهده کرد که شباهتهاي زیاد و یا کمی از نظر نوع کروموزومی در این دو گونه وجود دارد. مطالعات در سایرگونهها نیز نتایج مشابهی در برداشت. ریز بودن کروموزومهاي این سرده مطالعات را مشکل و در برخی موارد غیر ممکن کرده است.

هیبریداسیون در سرده براسیکا از سال 1834 شروع شده یعنی زمانی که هربرت (نقل از (28 موفق شد هیبرید F1

بین B. napus و B. rapa تولید نماید. در همین زمان ساگرت (نقل از (24 موفق به انجام تلاقی بین B. B. napus , oleracea و B. rapa به گونهاي که B. oleracea بعنوان والد نر بود شد. تا قبل از 1928 مطالعات جدي بر روي هیبریدهاي بین گونهاي وجود نداشت و اولین بار و مهم ترین آن را باید به موریناگا 21) و (22
نسبت داد. مطالعات وي همراه با مطالعات یو((31 و

کارپچنکو (19) نشان دادند که گونههاي با سطح پلوئیدي بالا (مثل B. cernua ,B.carinata و B. (napusآلوپلوئیدهایی هستند که ژنوم آنها از گونههایی با تعداد کروموزوم پایینتر یعنی n=8، n=9 و n=10 حاصل شدهاند.

ریچهاریکس (نقل از (23 سه تلاقی بین گونههاي 20

کروموزومی انجام داد و جفتشدگی کامل کروموزومی در

هر کدام از تلاقیها مشاهده کرد مگر در تلاقی B.

. B. rapa × pekinensis مطالعات بعدي نشان داد که

امکان تولید هیبریدهاي هگزا و اکتاژنومی وجود دارد 18)

و .(19 توصیف سیتوژنتیکی کروموزومها در سرده براسیکا بسیار مشکل است زیرا ژنوم A، B و C در متافاز میوز معمولاً بی شکل و بسیار کوچک هستند. چون سانترومر کروموزومها به خاطر کوچک بودن اندازه کروموزومها به خوبی مشخص نیست بنابراین گروهبندي آنها بر اساس طول کروموزومها می باشد. کروموزومها بسیار شبیه به هم هستند. این شباهتهاي چشمگیر بیانگر یکسان بودن منشاء آنها است.

موریناگا در سال (21)1933 کار خود را بر روي گونه هاي تتراپلوئید زراعی این سرده آغاز کرد. او اساس کار خود را در بی والنت هایی که تشکیل می شد قرار داد. B. napus

به وسیله یو (31) با تلاقی دادن B. oleracea با B. compestris در شرایط آزمایشگاهی سنتز شد. درسال
1935 یو((31 کار مورینگا را به صورت مثلثی که در هر رأس آن یک گونه دیپلوئید و در وسط اضلاع آن گونههاي تتراپلوئید قرار داشتند در آورد.

هیبریدهاي زیادي از تلاقی گونههاي وحشی×وحشی و زراعی×وحشی با مرتفع ساختن موانع باروري در این سرده به دست آمده است. دورگهگیري بدنی در این سرده نیز امکان پذیر است. مثلاً هیبریدي به نام Arabidobrassica

به همین روش به دست آمده است (گلبا و هافمن،1980

نقل از .(23 یکی از مهم ترین دستآوردها در این زمینه تولید دورگههاي آلوپلاسمیک نرعقیم است. دستآورد دیگر انتقال ژنهاي هستهاي مفید از طریق اینترگرسیون است که در این راستا میتوان به ژنهاي مقاومت به انواع بیماریها اشاره نمود. این هیبریدها احتمالاً از عدم کاهش کروموزومی B.oleracea و کاهش در گامت B.napus بوده

447

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

است. چوري و همکاران (10) در سال 1996 قدرت انتقال ابتدا بذور جمع آوري شده به دقت به وسیله سدیم
ژنهاي طبیعی را در دو نسل تلاقی برگشتی مورد آزمون هیپوکلریت 0/5 در صد به مدت یک دقیقه ضد عفونی
قرار دادند. آنها شاهد افزایش باروري در هر دو نسل بودند شدند. سپس از هر ژنوتیپ حدود 50 عدد بذر انتخاب و
به خصوص زمانی که B.napus به عنوان والد مادري در ظروف پتري حاوي ماسه نرم ضدعفونی شده کشت و
انتخاب شد. این نشان داد که میزان باروري نتاج F1 به در دماي 20 درجه سانتی گراد قرار داده شدند. زمانی که
دست آمده از تلاقی بین گونه اي را میتوان با تلاقی طول ریشهچهها به 1-2 سانتیمتر رسید مراحل زیر بر روي
برگشتی افزایش داد. آنها اعمال گردید.
اکثر مطالعات انجام شده 3) و (5 در ایران محدود به با توجه به ریز بودن بذرها کل نمونهها شامل بذر و
مقایسه ارقام زراعی وارداتی و نهایتاً توصیه آنها به زارعین ریشه ها بعد از شستشو حداقل به مدت 24 ساعت در
است و گزارشی در خصوص مطالعه کروموزومی گونههاي کلشیسین 0/05 درصد در دماي 4 درجه پیش تیمار شدند.
وحشی این سرده در دسترس نیست. در همین راستا مطالعه سپس نمونهها به مدت 5-10 دقیقه در آب مقطر شستشو و
حاضر با اهداف بررسی تنوع سیتوژنتیکی گونه هاي زراعی در محلول 3:1 استیک اسید : اتانل قرار داده شدند. طول
و وحشی سرده براسیکا، تعیین میزان قرابت کروموزومی و این مدت 2-7 روز در دماي 4 درجه بود. به همین دلیل
امکان تلاقی بین گونه اي این سرده و تعیین مهم ترین جهت هضم و تخریب مطلوب دیواره سلولی تیمارهاي
روش مطالعه کروموزومی گونههاي مورد بررسی طراحی مختلف شامل کلرهیدریک اسید، آنزیمهاي پکتیناز و
گردید. سلولاز، غلظتها و درجهحرارتهاي مختلف در سطوح
مواد و روشها متفاوت اعمال و در نهایت براي گونههاي مورد بررسی به
شرح زیر تیمارها حاصل گردید:


از مناطق مختلف شامل استانهاي کهگیلویه و بویر احمد، فارس و بوشهر به میزان کافی بذر از دو گونه خردل مدیترانهاي (خردل مدیترانه اي بوشهر، فیروزآباد، کازرون، گچساران، یاسوج، شیراز، نورآباد و دیلم ) و کلم وحشی

(کلم وحشی یاسوج و کلم وحشی کاکان ) جمع آوري گردید. همچنین بذور ارقام مختلف کلزاي بهاره و پاییزه

(هشت ژنوتیپ کلزاي بهاره شامل هایولا330، PP-401-15E، Rgsoo، Oftion 500، هایولا 60، هایولا401، PP-308-8، PP-401-16 و سه ژنوتیپ کلزاي پاییزه شامل کبري، اکاپی و طلایه) که در مناطق مختلف کشور کشت و کار می شوند تهیه و بعد از جمع آوري و ثبت مقدماتی مشخصات، بررسی کروموزومهاي میتوزي آنها به روش استوآیرون هماتوکسیلین به شرح زیر در آزمایشگاه ژنتیک دانشگاه یاسوج انجام شد.

• کلزا: نمونهها به مدت 10 دقیقه در کلرهیدریک اسید رقیق شده با آب مقطر (نسبت مساوي اسید و آب مقطر) تیمار شدند. سپس نمونهها از اسید خارج و با آب مقطر شستشو داده شدند. در مرحله بعد نمونهها به محلول حاوي آنزیمهاي پکتیناز و سلولاز منتقل و به مدت 15 دقیقه نگهداري شدند.

• کلم وحشی: نمونهها به مدت 7 دقیقه در کلرهیدریک اسید رقیق شده با آب مقطر (نسبت مساوي اسید و آب مقطر) تیمار شدند. سپس نمونهها از اسید خارج و با آب مقطر شستشو داده شدند. در مرحله بعد نمونهها به محلول حاوي آنزیمهاي پکتیناز و سلولاز منتقل و به مدت 10 دقیقه نگهداري شدند.

• خردل مدیترانه اي: نمونهها به مدت 5 دقیقه در کلرهیدریک اسید رقیق شده با آب مقطر (نسبت

448

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

مساوي اسید و آب مقطر) تیمار شدند. سپس نمونهها از اسید خارج و با آب مقطر شستشو داده شدند. در مرحله بعد نمونهها به محلول حاوي آنزیمهاي پکتیناز و سلولاز منتقل و به مدت 5 دقیقه نگهداري شدند.

بعد از اعمال تیمارهاي فوق شستشو با آب مقطر به مدت

10-15 دقیقه صورت پذیرفت و نمونهها حداقل به مدت

24 ساعت در محلول رنگآمیزي استوآیرون هماتوکسلین منتقل گردیدند. نمونههاي رنگآمیزي شده ابتدا در محلولی شفاف شامل آب و آنزیم با غلظت بسیار پایین قرار داده شدند. مریستم هر کدام از آنها شناسایی و بر روي لامی حاوي یک قطره استیک اسید 45 درصد منتقل شد. سپس با قرار دادن یک لامل و فشار مختصر عمل پخش شدن انجام شد. از هر ژنوتیپ سه نمونه مطلوب با مشاهده میکروسکوپی با بزرگنمایی 1000 انتخاب و به کمک یک سیستم اپتیکی مجهز به دوربین نیکون مدل Cool pix 14

تصاویر به رایانه منتقل و ذخیره شدند.

به وسیله نرم افزار امیج تول به طرز دقیقی مشخصات کروموزومی شامل طول کل کروموزوم، طول بازوي کوتاه، طول بازوي بلند برحسب پیکسل اندازه گیري شد.
با توجه به اینکه کروموزومها در مراحل مختلف طول متفاوت دارند نمیتوان در مقایسات به طول کل کروموزوم، طول بازوي کوتاه، طول بازوي بلند اعتماد نمود، به همین دلیل با استفاده از فرمولهاي زیر نسبت طولهاي فوق محاسبه و در تجزیهها استفاده شد.

طول کل ژنوم/طول هر کروموزوم= نسبت طول کل کروموزوم
طول کل ژنوم/طول بازوي کوتاه کروموزوم= نسبت طول بازوي کوتاه کروموزوم

طول کل ژنوم/طول بازوي بلند کروموزوم= نسبت طول بازوي بلند کروموزوم

(طول هر کروموزوم/طول بازوي کوتاه) = 100×شاخص سانترومري

به علاوه از نسبتهاي به دست آمده جهت محاسبه موارد زیر استفاده شد:
× 100 (مجموع طول کل کروموزوم/ مجموع طول کل بازوهاي کوتاه)=درصد شکل کلی (TF%)

کمترین طول نسبی کروموزوم- بزرگترین طول نسبی =

اختلاف طول نسبی((DRL

n Si

A1 1 i1nLi

در این فرمول A1 شاخص عدم تقارن درون کروموزومی، n

تعداد جفت کروموزوم هومولوگ، Si و Li به ترتیب طول متوسط بازوهاي کوتاه و بلند هر جفت کروموزوم هومولوگ میباشند.

A2  Sd

در این فرمول A2 شاخص عدم تقارن بین کروموزومی، Sd انحراف معیار تفاوت میانگینهاي طول نسبی کل کروموزوم و  میانگین طول نسبی کل کروموزوم

می باشند.

بعد از اندازهگیري موارد فوق ابتدا آزمون نرمال بودن مشاهدات انجام و سپس تفاوت بین ژنوتیپهاي هر گونه به طور مجزا با استفاده از تحلیل واریانس بررسی گردید.

مقایسه میانگین ژنوتیپها براي ویژگیهایی که معنیدار گردیدند به روش دانکن انجام شد. سپس تفاوت بین گونههاي مورد مطالعه از نظر ویژگیهاي تعداد کروموزومهاي بدنی، A1، A2، DRL و TF به کمک تحلیل واریانس بررسی شد. گروه بندي ژنوتیپهاي هر سه گونه جهت تعیین میزان قرابت آنها از طریق تجزیه خوشهاي و روش UPGMA صورت پذیرفت و در نهایت ژنوتیپهایی

449

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

به عنوان والد براي تلاقی و دورگهگیري در برنامههاي ارقام مختلف کلزا از نظر نسبت طول کل کروموزومهاي
اصلاحی انتخاب شدند. شماره یک تا 19 تفاوت معنیداري با هم نداشتند. از نظر
نتایج و بحث سایر ویژگیهاي اندازهگیري شده نیز در اکثر موارد تفاوت
غیر معنی دار بود به جز از نظر نسبت طول بازوي بلند
شکل 1 نمونه کروموزومهاي بدنی ژنوتیپهاي کلزاي مورد
براي کروموزومهاي شماره 10، 11 و 13؛ از نظر نسبت
مطالعه را نشان میدهد. در همین راستا نتایج حاصل از طول بازوي کوتاه براي کروموزومهاي شماره 1، 4، 12، 13
تحلیل واریانس یک طرفه ویژگیهاي کروموزومی در و 16 و شاخص سانترومري براي کروموزومهاي شماره 1،
جدول 1 آمده است. تعداد کروموزومهاي بدنی کلیه ارقام 12، 13، 14، 15 و .16
مورد مطالعه 2n=38 بود. همان گونه که ملاحظه میگردد

ھايوال 401 کبری
اکاپ ي

Rgsoo ھايوال 330 ھايوال 60
شکل -1 کروموزومهاي میتوزي ارقام مختلف کلزاي مورد مطالعه

450

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

pp-308- 8 pp-401-15 E

Oftion 500 pp-401-16

طالي ه

ادامه شکل 1

451

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
جدول -1 میانگین مربعات ویژگیهاي کروموزومی اندازهگیري شده در ارقام پاییزه و بهاره کلزا
شماره نسبت طول شاخص سانترومري
کروموزوم کل کروموزوم بازوي بلند بازوي کوتاه
1 0/1016 ns 0/1619 ns 0/1164 ** 71/313 *
2 0/ 1404 ns 0/1632 ns 0/1630 ns 38/143 ns
3 0/0602 ns 0/0621 ns 0/0906 ns 47/502 ns
4 0/0288 ns 0/0372 ns 0/1432 * 62/081 ns
5 0/0604 ns 0/0697 ns 0/0332 ns 29/117 ns
6 0/0229 ns 0/0488 ns 0/0504 ns 32/591 ns
7 0/0369 ns 0/0753 ns 0/0865 ns 84/623 ns
8 0/0221 ns 0/1202 ns 0/0745 ns 98/148 ns
9 0/0221 ns 0/0583 ns 0/0350 ns 23/961 ns
10 0/0145 ns 0/0968 * 0/0556 ns 48/711 ns
11 0/0415 ns 0/0781 * 0/0624 ns 60/848 ns
12 0/0270 ns 0/0624 ns 0/1047 * 124/844 *
13 0/0211 ns 0/0837 ** 0/1535 ** 209/717 **
14 0/0797 ns 0/1494 ns 0/0563 ns 118/281 *
15 0/0922 ns 0/0600 ns 0/0640 ns 143/970 *
16 0/0508 ns 0/0638 ns 0/1491 ** 218/157 **
17 0/0940 ns 0/0846 ns 0/0372 ns 53/850 ns
18 0/0548 ns 0/0338 ns 0/0571 ns 111/089 ns
19 0/0427 ns 0/0415 ns 0/0673 ns 172/785 ns

ns، * و ** به ترتیب غیر معنی دار و معنی دار در سطوح احتمال پنج و یک در صد را نشان می دهند.

بر اساس مشاهدات مربوط به مقایسه میانگینها (مشاهدات نشان داده نشدهاند) بالاترین نسبت طول بازوي بلند کروموزومهاي شماره 10 و 11 مربوط به رقم اکاپی و کروموزوم شماره 13 به رقم Rgsoo اختصاص یافت.

کمترین نسبت بازوي بلند کروموزومهاي شماره 10، 11 و 13 به ترتیب مربوط به ارقام طلایه، کبري و pp-401-15E

بود. بالاترین نسبت طول بازوي کوتاه براي کروموزومهاي شماره 1، 4، 12، 13 و 16 به ترتیب به ارقام هایولا401،

هایولا330، pp-308-8، طلایه و هایولا330 اختصاص یافت در حالی که کمترین آنها به ترتیب متعلق به ارقام Rgsoo، pp-401-15E، اکاپی، هایولا330 و oftion500 بود.

با توجه به تعدد صفات اندازه گیري این تفاوتها فاحش نیستند اما همین مقدار تفاوت مؤید وجود منبع مفید ژنتیکی جهت به کارگیري در برنامههاي اصلاحی است.
در رابطه با کلزا مطالعات کاریوتیپی صورت پذیرفته که به برخی از آنها اشاره میگردد:
شیدایی و همکاران (26) با بررسی کروموزومهاي میوزي

50 رقم کلزا تعداد کروموزومهاي هاپلوئید را 19 عدد گزارش نمودند. آنها تفاوت معنیداري بین ارقام مورد مطالعه از نظر فراوانی وقوع و نحوه توزیع کیاسما مشاهده کردند. مرتضوي و همکاران (4) با بررسی کاریوتیپی رقم مودنا کلزا تعداد کروموزومها را 38 و احتمال تریزومی در کروموزوم شماره 3 را گزارش کردند. میرزایی ندوشن و

452

مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392

همکاران (6) در مطالعه سیتوژنتیکی نه رقم کلزاي زراعی که در ایران کشت می شوند تفاوت بین آنها از نظر ویژگیهاي کروموزومی معنی دار گزارش نمودند. آنها همبستگی ارقام از نظر طول کل کروموزوم را معنی دار ولی از نظر طول بازوي بلند و بازوي کوتاه غیرمعنی دار بیان کردند.

در مقایسه با این مطالعات نتیجه حاصل از مطالعه حاضر تنوع کمتري در بین ارقام کلزا از نظر ویژگیهاي کروموزومی نشان داد. استفاده از نسبت طول به جاي طول مطلق به دلیل اینکه تحت تأثیر مرحله تقسیم قرار نمیگیرد نتایج واقعیتري ارائه میدهد.

شکل 2 کروموزومهاي متافازي میتوز و جدول 2 نتیجه تحلیل واریانس ویژگیهاي کروموزومی در ژنوتیپهاي خردل مدیترانهاي را نشان میدهند.

تعداد کروموزومهاي کلیه تودههاي جمعآوري شده 2n=14

بود. ژنوتیپهاي مورد مطالعه از نظر خصوصیات اندازهگیري شده تفاوت معنیداري نشان ندادند به جز براي نسبت طول بازوي کوتاه کروموزوم شماره .3 این نتیجه به وضوح نشان میدهد که کلیه خردلهاي وحشی مورد مطالعه علی-

رغم اینکه از مناطق مختلف با شرایط آب و هوایی کاملاً متفاوت جمع آوري شدند اما تنوع کروموزومی ندارند. این نتیجه داراي این مزیت است که میتوان ریختی کروموزومی را به تمام خردلهاي مدیترانهاي ایران تعمیم داد. این گیاه در اکثر مناطق ایران و در مزارع مختلف به عنوان علف هرز و به صورت خودرو رشد میکند که خود بیانگر سازگاري فوقالعاده آن میباشد.

مقایسه میانگین تودههاي مورد مطالعه از نظر تنها صفت معنی دار شده یعنی نسبت طول بازوي کوتاه کروموزوم شماره 3 نشان داد که بالاترین میانگین به توده نورآباد1 و
کمترین آن به توده گچساران اختصاص دارد.

در شکل2 شباهتهاي کروموزومی بین کلیه تودهها به صورت مشاهدهاي نتایج حاصل از تجزیههاي آماري را تأیید می شود.