بخشی از مقاله
کشت ریشه های مویین گیاهان دارویی در بیوراکتورهای مختلف به منظور تولید متابولیتهای ثانویه دارویی
چکیده
کشت ریشههای مویین یک روش آزمایشگاهی است که مزایای زیادی را برای تولید تجاری متابولیتهای ثانویه دارد. ویژگیهایی از قبیل ثبات بالا از نظر ژنتیکی و بیوسنتزی، نگهداری آسان و قابلیت رشد در محیط کشت بدون هورمون، این ریشهها را به منبع دائمی برای تولید متابولیتهای ثانویه تبدیل کرده است. یکی از مهمترین محدودیتها برای تولید ریشههای مویین برای اهداف تجاری، دستیابی به تکنولوژی کشت در مقیاس وسیع می باشد. تاکنون این ریشهها در بیوراکتورهای مختلفی از جمله بیوراکتور مخزن همزندار، ستون حبابدار، هوا بالابر، بستر چکان و بیوراکتور مه پاش مواد غذایی کشت شدهاند. برای پاسخ به این سوال که کدام یک از این بیوراکتورها میتوانند بطور موفقیت آمیز در سطح تجاری و اقتصادی برای تولید متابولیتهای ثانویه مورد استفاده قرار گیرند، قابلیتها، مزایا و معایب هر کدام از سیستمهای فوق مورد بررسی قرار گرفته است.
واژههای کلیدی: اگروباکتریوم رایزوژنز، ریشههای مویین، متابولیتهای ثانویه، بیوراکتور، افزایش مقیاس
مقدمه
مواد شیمیایی مشتق شده از گیاهان منابع ارزشمندی برای مواد داروئی، طعم دهندههای غذایی، رنگ، روغن و رزین هستند. بسیاری از این مواد شیمیایی با ارزش متابولیتهای ثانویهای هستند که برای رشد گیاه ضروری نیستند ولی به مقدار کم در گیاه تولید میشوند و اغلب در بافتهای خاصی از گیاه انباشته میشوند. این ترکیبات ساختار پیچیدهای دارند و تولید آنها به روش شیمیایی امکانپذیرنیست و در نتیجه استخراج از گیاهان کاشته شده روش عمده تولید این مواد است. اما کشت بعضی گیاهان داروئی بر اساس روشهای رایج کشاورزی و بسته به گونه گیاهی به ماهها یا حتی سالها زمان برای دستیابی به گیاهان مورد نظر هستند و علاوه بر آن میزان تولید متابولیت تحت تاثیر عوامل مختلفی از جمله حمله پاتوژنها و شرایط محیطی متغیر قرار میگیرد. کشت سوسپانسیون سلولی گیاهی به عنوان جایگزین روش های رایج کشاورزی برای تولید متابولیتهای ثانویه با ارزش گیاهی مورد توجه قرار گرفته است. با وجود این که در تعدادی موارد کشت سوسپانسیون سلولی در سطح تجاری و صنعتی توسعه پیدا کرده است اما بزرگترین چالشی که پیش روی تولید متابولیتهای ثانویه گیاهی از طریق کشت سوسپانسیون سلولی وجود دارداین است که متابولیتهای ثانویه اغلب در سلولهای خاص یا در مرحله خاصی از نمو گیاه تولید میشوند و در سلولهای تمایز نیافته تولید نمیشوند. در نتیجه بیشتر تلاشها بر روی تولید متابولیتهای ثانویه در ریشه های مویین متمرکز شده است .(Baque, Moh, Lee, Zhong, & Paek, 2012)
کشت ریشههای مویین
کشت ریشههای مویین یک روش آزمایشگاهی است که مزایای زیادی را برای تولید تجاری متابولیتهای ثانویه دارد. ریشههای مویین بوسیله آلودگی بافت گیاهی با اگروباکتریوم رایزوژنز، یک باکتری خاکزی، ایجاد میشوند این باکتری بخشی از ماده ژنتیکی خود را که رمز کننده هورمونهای گیاهی است به درون سلول گیاهی منتقل میکند که نتیجه آن تکثیر سریع ریشهها در آن قسمت است .(Chilton et al., 1982) در مقایسه با ریشههای طبیعی، ریشههای مویین دارای رشد سریع بوده و همچنین این ریشهها دارای ویژگیهایی از قبیل ثبات بالا از نظر ژنتیکی و بیوسنتزی، نگهداری آسان و قابلیت رشد در محیط کشت بدون هورمون میباشند که این موضوع آنها را به عنوان منبع دائمی برای تولید متابولیتهای ثانویه تبدیل میکند. کشت ریشههای مویین روش مناسبی برای تولید متابولیتهایی هست که در ریشه گیاهان سنتز میشوند .(Mishra & Ranjan, 2008) علاوه بر آن، به علت طبیعت پایدار ریشههای مویین به عنوان یک سیستم عالی برای مطالعه فیزیولوژی و متابولیسم گیاهی هستند .(Hu & Du, 2006) یکی از مهمترین محدودیتها برای تولید ریشههای مویین برای اهداف تجاری دستیابی به تکنولوژی کشت در مقیاس وسیع می باشد. ریشههای مویین با توجه به فیزیولوژی و مورفولوژی خاصی که دارند باید ملاحظات ویژهای برای طراحی بیوراکتور برای کشت آنها مد نظر قرار گیرد از جمله فراهم اوردن شرایطی که کمترین استرس برشی را ایجاد کند و از طرفی کمترین محدودیت را در انتقال تودهای مواد مغذی و اکسیژن داشته باشد. ضخامت، طول و تعداد انشعابات ریشهای همگی بوسیله عوامل متعددی از جمله گونه گیاهی و سویه باکتری ایجاد کننده ریشه مویین تحت تاثیر قرار میگیرد. همه این عوامل به همراه رشد غیر یکنواخت ریشههای مویین، بهینه کردن شرایط رشد را پیچیدهتر کرده است. از طرف دیگر، مسئله اصلی در کشت ریشههای مویین در بیوراکتور تمایل آنها به ایجاد ساختارهای تودهای فشرده است که از ریشههای اولیه و انشعابات آنها تشکیل شده است و این مسئله فارغ از نوع بیوراکتور میباشد.
کشت در بیوراکتورها
بیوراکتورها بطور معمول یک مخزن با محیط استریل که محتوی محیط کشت مایع، سیستم ورود و خروج برای مایع و هوا هستند که برای بهینه کردن و کنترل شرایط کشت طراحی شدهاند که بطور معمول توانایی کنترل شرایط میکرو محیطی از قبیل pH، گازهای محلول، هوادهی و دما را برای رشد موجود زنده فراهم میآورند .(Paek, Chakrabarty, & Hahn, 2005)
انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در کشت ریشههای مویین
بیوراکتورهایی که برای کشت ریشه های مویین استفاده می شوند بر اساس فاز پیوستهای که دارند به سه دسته تقسیم می شوند: بیوراکتور فاز مایع، بیوراکتور فاز گاز و بیوراکتور ترکیبی که از ترکیب دو نوع بیوراکتور قبلی تشکیل شده است. نوع بیواکتور و شرایط کشت بر رشد و تولید ریشه های مویین تاثیر گذاراست. شرایط کشت شامل مواردی از قبیل سویه باکتری، ترکیب محیط کشت، میزان هوادهی، محرکها، نور و ... میباشد .(Eibl & Eibl, 2008) بهینه سازی شرایط رشد به همراه طراحی یک بیوراکتور مناسب، نقش کلیدی را در تولید انبوه متابولیتهای ثانویه از گیاهان ایفا می کند.
بیوراکتورهای فاز مایع
در این نوع بیوراکتور ریشهها در محیط مایع غوطه ور می شوند و واژه راکتور غوطه ور سازی نیز به این نوع از بیوراکتورها اطلاق می شود. بیوراکتور با سیستم مخزن همزندار,1 بیوراکتور با ستون حبابدار2، بیوراکتور هوا بالابر3، بیوراکتور دارای سیستم
حلقه چرخان در محیط مایع1، بیوراکتور نوع Rotating Drum و بیوراکتور با قرار می گیرند. در بیوراکتورهای ستون حبابدار (BCR)، هوا بالابر (ALR) و کشت مایع و تامین اکسیژن مورد نیاز برای ریشهها بجای بکار بردن همزن .(Wyslouzil, & Weathers, 2002سیستم جریان انتقالی2 در این دسته از بیوراکتورها liquid-impelled loop ، برای مخلوط کردن محیط مکانیکی، از هوادهی استفاده می شود (
بیوراکتور دارای مخزن همزندار((STR
یک بیوراکتور حالت مایع بوده و دارای یک همزن مکانیکی در قسمت پایین است. برای تامین اکسیژن برای فرایندهای هوازی، حبابهایی از هوای فشرده به داخل بیوراکتور پاشیده میشود یک وسیله هوادهی در محل پره همزن برای ایجاد فاز گازی یکنواخت در فاز مایع قرار داده میشود (شکل.(1 این نوع بیوراکتور بهطور معمول برای کشت ریشههای مویین مناسب نیست زیرا همزن موجب ایجاد زخم در ریشههای مویین شده و باعث ایجاد استرس برشی و تشکیل کالوس میشود. . این مشکل با بکار بردن قفسه یا توری استیل که ریشهها را از همزن جدا میکرد حل شد .(Doran, 1999) بیوراکتورهای STR تغییر یافته دارای همزنهای با پرههای مسطح بوده و علاوه بر آن ریشههای مویین روی یک توری نایلونی یا استیل تثبیت میشوند. حساسیت ریشههای مویین به استرس برشی بستگی زیادی به گونه گیاهی دارد. به عنوان مثال، برای ریشههای مویین گیاه Catharanthus roseus بکار بردن بستر توری که ریشهها را از قسمت پره جدا میکند ضروری است .(Nuutila, Toivonen, & Kauppinen, 1994) در حالیکه ریشههای مویین غیر شکننده گونه دیگر آن C. trichophyllus به طور موفقیت آمیز در بیوراکتور STR معمولی کشت شده است و بعد ازکشت حدود 10 g از ریشههای مویین C. trichophyllus در STR معمولی به مقدار 2500 g ریشه مویین بعد از 9.5 هفته بدست آمد. در مطالعهای دیگر ریشههای مویین Ophiorrhiza pumila در بیوراکتور STR تغییر یافته کشت شد و 182g وزن تر در لیتر بدست آمد که در مقایسه با ارلن مایر 100 ml که میزان 98.6 g وزن تر در لیتر تولید شده بود بهتر بود. هر چند مقدار نهایی کامپتوتسین در STR تغییر یافته 9.8mg در لیتر بود، که در مقایسه با ارلن 100 ml که 10.3 mg در لیتر کامپتوتسین تولید کرده بود تفاوت جزئی نشان میداد. اگرچه ریشه های مویین O. pumila تنها به مقدار جزئی در اثر همزدن و هوادهی در STR دچار آسیب میشد اما تولید کامپتوتسین در سطح انبوه در این سیستم امکانپذیر نیست ( Mishra & Ranjan, .(2008 در یک آزمایش دیگر، ریشههای مویین Atropa Belladonna در سطح انبوه در STR سه لیتری کشت شد که در آن یک قفسه توری از جنس استیل نیز بکار برده شده بود که علاوه بر اینکه به عنوان بستر تثبیت عمل میکرد ریشههای مویین را نیز از همزن جدا نگه میداشت. در پایان کشت میزان 5.4 mg آتروپین در هر گرم وزن خشک بدست آمد که برابر با میزان آتروپین تولید شده در ریشههای رشد یافته در مزرعه بود و علاوه بر آن حاوی مقدار قابل توجهی از آلکالوئیدهای دیگر نیز بود. در این مطالعه روشن شد که این نوع بیوراکتور میتواند اکسیژن و مواد مغذی کافی را برای رشد ریشهها و تولید آتروپین فراهم آورد ( Lee .(et al., 1999
شکل (1) بیوراکتور دارای مخزن همزندار (STR)
بیوراکتور با ستون حبابدار((BCR
در این نوع بیوراکتور ریشهها در محیط مایع بصورت غوطهور کشت میشوند و یکنواخت کردن محیط بوسیله گردش رو به بالای حبابهای هوای تولید شده از یک پخش کننده هوا که در قسمت پایین ستون بیوراکتور قرار دارد، بدست میآید (شکل.(2 در تحقیقی، محققان ریشههای مویین گیاه Artemisia annua را در دو سیستم BCR و NMR کشت دادند و بیشترین میزان تولید وزن تر را به مقدار 259 g و 252 g به ترتیب در BCR و NMR گزارش کردند که نشان دهنده کارایی بهتر BCR برای رشد ریشههای مویین A. annua میباشد. استفاده از یک استوانه غشایی از جنس پروپیلن به عنوان یک وسیله تامین کننده هوا باعث افزایش تولید بیوماس به میزان 32 تا 65 درصد در Atropa belladonna گردید. نتایج این بررسیها اهمیت توسعه روشها و ابزارهایی برای هوادهی هدفمند ریشههای مویین و رهایش اکسیژن در محل دارای ریشههای متراکم را روشن ساخت ( Y. J. Kim, .(Weathers, & Wyslouzil, 2002 در مطالعهای دیگر کارایی BCR با تقسیم کردن ستون به چندین قسمت و قرار دادن پخش کننده هوا در هر قسمت بهبود پیدا کرد و حداکثر تولید ریشههای مویین از 1.3 g وزن خشک در لیتر در بیوراکتور 2.5 ALR لیتری به 9.9 g وزن خشک بر لیتر در BCR رسید .(Mishra and Ranjan, 2008)
شکل((2 بیوراکتور با ستون حبابدار (BCR)
بیوراکتور با سیستم هوا بالابر (ALR)
بیوراکتور ALR میتواند به عنوان یک BCR حاوی یک استوانه مرکزی توصیف شود. پخش کننده هوا در این نوع بیوراکتور یک وسیله حلقوی است که در قسمت پایینی استوانه مرکزی قرار دارد و باعث جریان هوا و گردش محیط میشود (شکل.(3 انتقال تودهای اکسیژن به عنوان عامل اصلی محدود کننده در اکثر بیوراکتورهای فاز مایع میباشد زیرا همزدن مکانیکی و استرس برشی باعث سازمان یافتگی غیر عادی ریشهها و تشکیل کالوس میشود که هر دو عامل فوق منجر به کاهش تولید میگردد. اگرچه ALRهای رایج بهطور گسترده برای کشت ریشههای مویین مورد استفاده قرار گرفتهاند اما این نوع از بیوراکتورها نمیتوانند تولید بهینهای از ریشه های مویین را داشته باشند که این مسئله میتواند ناشی از دو عامل باشد: اول اینکه توزیع یکنواختی از بافت ریشهای در ناحیه معینی از بیوراکتور وجود ندارد و دوم اینکه هدایت بیش از حد گاز، باعث مسدود شدن جریان مایع به علت تودهای شدن بافت ریشهای میشود .(Mishra & Ranjan, 2008)
شکل((3 بیوراکتور با سیستم هوا بالابر (ALR)
تحقیقات نشان داده است زمانیکه ریشههای مویین تثبیت شوند میزان تولید وزن تر در ALR بطور چشمگیری افزایش مییابد .(Taya, Yoyama, Kondo, Kobayashi, & Matsui, 1989) در حالی که بیوراکتورهای نوع BCR حتی با وجود بستر تثبیت کننده نیز در تولید بهینه ریشه های مویین Hyoscyamus Muticus موفقیت آمیز نبودهاند .(Mishra and Ranjan, 2008) در بیوراکتورهای ALR استوانه مرکزی با انتقال حبابهای هوا در یک جهت و توزیع استرس برشی بطور یکنواخت در سرتاسر بیوراکتور از تشکیل حباب جلوگیری میکند. در نتیجه سلولها میتوانند در یک شرایط فیزیکی پایدارتر نسبت به شرایط محیطی با استرس برشی بالا که منجر به آسیب سلولی و کاهش تولید میشود رشد کنند. مطالعهی مقایسهای بین انواع مختلفی از بیوراکتورهای ALR با اشکال مخروطی، بالن، لامپ و ستونی، هرکدام با ظرفیت 5 لیتری انجام گرفت و نتایج نشان داد که ALR مخروطی شکل بیشترین میزان وزن تر و بتاسیانین را در ریشه های مویین Beta. vulgaris تولید میکند. آزمایشات فوق نشان دادند که ALR مناسبترین نوع بیوراکتور برای کشت ریشههای مویین B.vulgaris میباشد. تولید آرتمیزین نیز در چهار سیستم مختلف با ظرفیت 3 لیتر شامل ارلن مایر، BCR، BCR تغییر یافته و ALR تغییر یافته مورد مطالعه قرار گرفت. میزان آرتمیزین در ریشههای مویین رشد یافته در ALR تغییر یافته، BCR و BCR تغییر یافته به ترتیب برابر با 0.536،
