بخشی از مقاله
استخراج و آنالیز اسانس گیاه مرزنجوش، شناسایی ترکیب طبیعی کارواکرول و تعیین ساختار ضروری جهت فعالیت آنتی باکتریایی کارواکرول
چکیده :
این کار پژوهشی بر روی گیاه مرزنجوش انجام گرفت. مرزنجوش، گیاهی است پایا، از تیره نعناعیان که دارای خواص درمانی زیادی می باشد. این گیاه از جنگل های ارسباران جمع آوری شد و به منظور انجام بررسی های فیتوشیمیایی اندام هوایی گیاه خشک و پودر شدند. اسانس این گیاه که به اسانس اوریکان موسوم است با استفاده از دستگاه کلونجر استخراج شد و سپس به وسیله تست های شیمیایی مورد آنالیز قرار گرفت. وجود ترکیب طبیعی کارواکرول از طریق آنالیز HPLC تایید شد.
ترکیب فنلی غالب اسانس این گیاه ترکیب طبیعی کارواکرول می باشد که دارای اثرات درمانی فراوانی می باشد. این ترکیب از اسانس گیاه مرزنجوش استخراج شد. مشتق سازی سیلیسیمی بر روی این ترکیب طبیعی انجام شد و طیف های FT-IR و FT-NMR این مشتقات گرفته شد.
در ادامه این کار پژوهشی خاصیت آنتی اکسیدانی کارواکرول و مشتقات آن با دو روش FRAP و DPPH اندازه گیری شد و از لحاظ خاصیت آنتی اکسیدانی با هم مقایسه شد. در پایان کار تحقیقاتی حاضر، فعالیت آنتی باکتریایی کارواکرول و چند مشتق آن با استفاده از روش انتشار بررسی شد و ساختار ضروری لازم جهت اعمال خاصیت آنتی باکتریایی کارواکرول تعیین شد.
جنس Origanum جزو خانواده نعناعیان می باشد که دارای گونه های زیادی می باشد. Origanum Vulgare گیاهی است پایا، به ارتفاع 30 تا 60 سانتیمتر و دارای بوی معطر که به حالت خودرو در نواحی خشک، سواحل دریاها، دامنه کوهستان ها و جنگل های نواحی مختلف اروپا و نواحی جنوب غربی و مرکزی آسیا همچنین در ایران در استان آذربایجان شرقی، منطقه جنگلهای ارسباران - نواحی مختلف شمال ایران مانند لاهیجان، آسپینا، آستارا می روید. بعلاوه به منظور استفاده های درمانی نیز پرورش می یابد.] مضفریان، .1386 زرگری، [1369
شکل:1 گیاه مرزنجوش
کارواکرول یک ترکیب طبیعی فنولی است که به عنوان یکی از اجزای اصلی اسانس ها در نظر گرفته می شود که فعالیت های ضد میکروبی نه تنها به دلیل فراوانی آن در برخی اسانس ها، که سطح آن به %75 می رسدArrebola et al, 1994. So¨kmen et al, ] .[2004 بلکه به دلیل فعالیت خاص خود در مقایسه با اجزای دیگر اسانس ها است. مطالعاتی که بر روی خاصیت ضد باکتریایی کارواکرول انجام شده است نشان داده است که آن به طیف گسترده ای از فعالیت های ضد میکروبی در برابر تقریبا هر باکتری گرم مثبت و منفی تست شده است.[Friedman et al, 2002]
علاوه بر این فعالیت ضد میکروبی، کارواکرول به عنوان ضد قارچ[Tampieri et al, 2005]، آنتی اکسیدان[Ultee et al, 2001]، ضد حشره[Ahn et al, 1998] و ضد انگل[Lindberg et al, 2000] معرفی شده است. تمام اسانس ها که حاوی کارواکرول هستند جزء عظیمی از فعالیت های ضد ویروسی را از خود نشان می دهند.[ Allahverdiyev et al, 2004. Garcia et al, 2003 ] ترکیب طبیعی کارواکرول جزء اصلی تشکیل دهنده اسانس گیاه مرزنجوش است که حدودأ %30 تا%70 اسانس این گیاه را در بر دارد. کارواکرول یک فنل مونوترپنوئید است.
نیز شناخته می شود.و دارای فورمول شیمیایی C10H14O و وزن مولکلی 150.22 g/mol و دانسیته °C) می باشد. کارواکرول یک جزء مهم و بزرگ اسانس گیاه مرزنجوش است. که در اسانس تعدادی از گیاهان مانند ترنج وحشی، و آویشن نیز یافت می شود. تست آزمایشگاهی بر روی مرزنجوش وجود خاصیت ضدباکتریایی، ضدقارچ، ضدویروسی، ضدسرطانی و000 را نشان داده است. مهمترین مزیت ترکیب طبیعی کارواکرول تعامل این ترکیب طبیعی با باکتری ها و گیرنده ها در بدن انسان است.[Ultee et al, 2000. Vincenzi, 2004] همچین کارواکرول دارای خاصیت های ضدسرطانی، ضدمیکروبی، آنتی اکسیدانی، ضدقارچ، اکسیداسیون اسید چرب می باشد. [Karimian et al, 2011. Terenina et al, 2011. Zuzarte et al, 2012 [در این کار پژوهشی ترکیب طبیعی کارواکرول از گیاه مرزنجوش استخراج شد و چند مشتق سیلیله آن سنتز شد سپس کوپلیمر های آن سنتز شدند و رهایش کاراکرول بررسی شد و در ادامه خواص آنتی اکسیدانی و آنتی باکتریایی کارواکرول و مشتقات آن بررسی شد.
نتایج
بخش مربوط به نمونه های گیاهی
جمع آوری نمونه گیاهی از بخش های هوایی گیاه مرزنجوش در تیر ماه سال 1391 از منطقه جنگلهای ارسباران انجام پذیرفت. مختصات جغرافیایی و ارتفاع منطقه جمع آوری نمونه گیاهی بدین صورت است: استان آذربایجان شرقی، شهرستان کلیبر، منطقه جنگلهای ارسباران، اطراف روستای کلاله علیا. ارتفاع محل جمع آوری گیاه 1250 – 1100 متر و به مختصات جغرافیایی با عرض شمالی 38 56 23 و طول شرقی 46 45 34 می باشد. تصویر تهیه شده از منطقه جمع آوری نمونه گیاهی با گوگل ارس:
شکل :3 تصویر تهیه شده با گوگل ارس از منطقه جمع آوری گیاه
بخش مربوط به مطالعات فیتوشیمیایی اسانس
استخراج اسانس
اندام های هوایی نمونه گیاهی خشک شده شامل برگ و گل به روش تقطیر با آب (Hydrodistillation) توسط دستگاه کلونجر اسانس گیری شد. به این منظور، مقدار 100 گرم از پودر نمونه گیاهی به همراه 400 میلی لیتر آب مقطر در یک بالن ریخته شد و دستگاه کلونجر بر روی بالن نصب گردید. بعد از حدود 4-3 ساعت عمل تقطیر (تا ثابت ماندن حجم اسانس حاصل) اسانس جداسازی و پس از ریخته شدن در میکروتیوپ ها و آبگیری در یخچال نگهداری شدند. اسانس های بدست آمد ه قبل از آنالیز توسط سولفات سدیم بدون آب، آبگیری شدند.
آنالیز اسانس
محتوای اسانس با استفاده از دستگاه HPLC متصل به آشکارساز UV مورد آنالیز قرار گرفت و ترکیب طبیعی کارواکرول در نمونه گیاهی شناسایی و توسط داده های HPLC اثبات شد. قسمتی از اسانس استخراج شده برای بدست آوردن کارواکرول خالص بدین صورت تحت آنالیز قرار گرفت که ابتدا برروی آن مقداری NaOH ریخته شد تا ترکیبات فنولی آن رسوب کند طبق نتایج مقالات، مقدار کارواکرول موجود در اسانس گیاه مرزنجوش بسته به شرایط بین 80-60 درصد می باشد. یعنی ترکیب فنولی غالب اسانس گیاه مرزنجوش کارواکرول می باشد. سپس رسوب را جداسازی کرده و توسط HCL خنثی شد و سپس این ترکیبات فنولی را که غالبأ دارای کارواکرول است توسط پلیت زدن و با توجه به اینکه شاهد کارواکرول در اختیار بود و با لکه گذاری کارواکرول خالص به عنوان شاهد، کارواکرول جداسازی شد. که طیف FT-IR, H-NMR, Mass این ترکیب طبیعی نیز نهیه شد.
شناسایی ساختار ترکیب طبیعی کارواکرول
HPL1)
قسمتی از اسانس بدست آمده با استفاده از دستگاه کلونجر، جهت شناسایی ترکیب طبیعی کارواکرول مستقیمأ توسط دستگاه HPLC مورد آنالیز قرار گرفت. وجود ترکیب طبیعی کارواکرول از طریق آنالیز HPLC تایید شد. آنالیز HPLC اسانس پیک یک تایی با شدت جذب 22500 در زمان بازداریَ20/5 نشان می دهد که دقیقأ منطبق با پیک های ماده استاندارد خریداری شده است.
قسمتی از اسانس استخراج شده برای بدست آوردن کارواکرول خالص بدین صورت تحت آنالیز قرارگرفت که ابتدا باروش حلال به حلال نمونه تقریبا خالص سازی شد سپس با استفاده از کروماتوگرافی لایه نازک کارواکرول استخراج شد. که طیف FT -IR, H-NMR, Mass این ترکیب طبیعی در زیر آورده شده است.
(2) طیف FT-IR
پیک پهن در ناحیه 3392 cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی O-H فنولی می باشد. پیک در ناحیه 3020 cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C-H آروماتیک، در 2927 cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی نامتقارن C-H آلیفاتیک، در 2869 cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی متقارن C-H آلیفاتیک، پیک تیز در 1620 cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C=C آروماتیک می باشد.
(3) طیف جرمی
فرقمنت مشاهده شده در m/e=135 مربوط به قطعه مولکلی [A-CH3] و فرقمنت مشاهده شده در m/e=107 مربوط به قطعه مولکلی -A]گروه ایزوپروپیل[ می باشد. فرقمنت مشاهده شده در m/e=91 مربوط به قطعه مولکلی تروپلیوم می باشد. فرقمنت مشاهده شده در m/e=77 مربوط به قطعه مولکلی فنیل می باشد.
(4) طیف H-NMR
پیک دوتایی در ناحیه 1/3 ppm مربوط به 6 پروتون گروه متیل،ایزوپروپیل متصل به حلقه آروماتیک است. پیک تک شاخه در ناحیه 2/3 ppm مربوط به 3 پروتون گروه متیل متصل به حلقه آروماتیک است. پیک در ناحیه 2/9 ppm مربوط به 1 پروتون گروه ایزوپروپیل است که توسط 6 پروتون گروه مجاور به یک هفت تایی شکافته شده است. پیک پهن تک شاخه در ناحیه ppm 5/8مربوط به 1 پروتون گروه هیدروکسیل متصل به حلقه آروماتیک است. پیک تک شاخه در ناحیه 6/7 ppm مربوط به 1 پروتون متصل به حلقه آروماتیک است. پیک در ناحیه 6/8 ppm مربوط به 1 پروتون متصل به حلقه آروماتیک است که توسط پروتون مجاور خود به یک دو تایی شکافته شده است. پیک در ناحیه 7/1 ppm مربوط به 1 پروتون حلقه آروماتیک است که توسط پروتون مجاور خود به یک دوتایی شکافته شده است.
سنتز مشتقات سلیله
باز استفاده شده تری اتیل آمین و حلال مورد استفاده THF خشک می باشد. رفلاکس سیستم به مدت 24 ساعت تحت گاز آرگون در دمای محیط و پیشرفت واکنش با TLC کنترل شد. در ادامه بعد از 24 ساعت محصول بوسیله کروماتوگرافی لایه نازک با سیستم حلال -nهگزان و اتیل استات جداسازی شد. و با خشک کردن محصول تحت خلاء، محصول خالص که به رنگ مایع زرد رنگ بود، بدست آمد. همجنین تمام واکنش ها بدون حضور کاتالیزور انجام گرفتند.
تری اتیل کلرو سیلان، وینیل دی متیل کلرو سیلان ، تری اتیل آمین ، سدیم هیدروکسید ، Sigma-Aldrich تهیه شدند. پلیت های TLC از نوع سلیکاژل و سیلیکاژل لایه نازک 60 بود.
که از کمپانی Merck , Fluka, GF 254 ساخت شرکت merck
سنتز تری اتیل سیلوکسی کارواکرول
این سنتز طبق دستورکار انجام گرفت که طیف های FT-IR , H-NMR محصول واکنش را اثبات می کنند.
شکل :6 تری اتیل سیلوکسی کارواکرول
(1)طیف FT-IR
پیک در ناحیه 3047cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C-H آروماتیک، در2914cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی نامتقارن C-H آلیفاتیک، در 2877cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی متقارن C-H آلیفاتیک می باشد.پیک مربوط به ارتعاشات کششی Si-C در 1273cm−1 و مشاهده شدن پیک مربوط به ارتعاشات خمشی Si-C در819cm−1 و پیک تیز در 1612cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C=C آروماتیک و پیک1056cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی Si-O می باشد. و در نهایت عدم وجود پیک مربوط به OH کارواکرول در ناحیه حدود 3100-3400cm−1 نشان از سنتز ترکیب مورد نظر می باشد.
(2)طیف H-NMR
پیک در ناحیه0/8ppm مربوط به 6 پروتون متیلن متصل به سیلیسیم که توسط سه پروتون متیل مجاور به یک چهار تایی شکافته می شود، پیک در ناحیه 1/1ppm مربوط به 9 پروتون متیل که توسط گروههای متیلن کناری به سه تایی شکافته می شود. پیک در ناحیه 1/3ppm مربوط به 6 پروتون گروه های متیل ایزوپروپیل متصل به حلقه آروماتیک است که توسط تک پروتون ایزوپروپیل به دوتایی شکافته می شود. پیک تک شاخه در 2/25ppm مربوط به 3 پروتون گروه متیل است که روی حلقه آروماتیک قرار دارد. پیک در ناحیه 2/9ppm مربوط به یک پروتون گروه ایزوپروپیل است که توسط 6 پروتون متیل گروه ایزوپروپیل به هفت تایی شکافته شده است. پیک یک تایی در ناحیه 6/37ppm مربوط به 1 پروتون حلقه آروماتیک است. پیک در ناحیه 6/8ppm مربوط به 1پروتون حلقه آروماتیک است که توسط پروتون مجاور خود به یک دو تایی شکافته شده است و پیک دوتایی در ناحیه 7/1ppm مربوط به یک پروتون حلقه آروماتیک می باشد.
سنتز وینیل دی متیل سیلوکسی کارواکرول
این سنتز طبق دستورکار انجام گرفت که طیف های FT-IR , H-NMR محصول واکنش را اثبات می کنند.
شکل:8 وینیل دی متیل سیلوکسی کارواکرول
(1)طیف FT-IR
پیک در ناحیه3052cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C-H آروماتیک، در 2927cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی نامتقارن C-H آلیفاتیک، در2871cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی متقارن C-H آلیفاتیک می باشد.پیک مربوط به ارتعاشات کششی Si-C در1262cm−1 و مشاهده شدن پیک مربوط به ارتعاشات خمشی Si-C در840cm−1 و پیک تیز در 1613cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی C=C آروماتیک و پیک1056cm−1 مربوط به ارتعاشات کششی Si-O می باشد. و در نهایت عدم وجود پیک مربوط به OH کارواکرول در ناحیه حدود3100-3400cm−1 نشان از سنتز ترکیب مورد نظر می باشد.
(2)طیف H-NMR
پیک در ناحیه 0/5ppm مربوط به 6 پروتون دو گروه متیل متصل به سیلیسیم می باشد. پیک دو تایی در ناحیه 1/35ppm مربوط به 6 پروتون گروه متیل ایزوپروپیل متصل به حلقه آروماتیک است. پیک در ناحیه 2/3ppm مربوط به 3 پروتون گروه متیل متصل به حلقه آروماتیک می باشد. پیک در ناحیه 2/9ppm مربوط به یک پروتون گروه ایزوپروپیل است که توسط 6 پروتون متیل همان گروه به یک هفت تایی شکافته شده است. پیک در ناحیه 6ppm مربوط به 1 پروتون گروه وینیل، پیک در ناحیه 6/2ppm مربوط به پروتون دیگر گروه وینیل است. پیک در ناحیه 6/4ppm نیز مربوط به یک پروتون گروه وینیل است. پیک یک تایی در ناحیه 6/85ppm مربوط به 1 پروتون حلقه آروماتیک است. پیک در ناحیه 6/9ppm مربوط به 1پروتون حلقه آروماتیک است که توسط پروتون مجاور خود به یک دو تایی شکافته شده است و پیک دوتایی در ناحیه 7/15ppm مربوط به یک پروتون حلقه آروماتیک می باشد.
شکل :9 طیف H-NMR و FT-IR ترکیب وینیل دی متیل سیلوکسی کارواکرول
بررسی خواص آنتی اکسیدانی نمونه ها
در این کار پژوهشی فعالیت آنتی اکسیدانی ترکیب طبیعی کارواکرول (P42) و مشتق وینیل دی متیل سیلوکسی کارواکرول (P41) که با حذف گروه هیدروکسیل از ترکیب طبیعی کارواکرول و قرار دادن وینیل دی متیل سیلان به جای آن انجام گرفت. با استفاده از روش پاکسازی رادیکال آزاد (DPPH) و روش توانایی آنها در احیای آهن فریک (FRAP) مورد ارزیابی قرار گرفت.
روش FRAP
روش ( Ferric Reduciting Ability Plasma ) یا همان FRAP ، اساس این روش توانایی ماده مورد نظر در احیای یون های فریک (Fe+3) به فرو (Fe+2) با استفاده از معرفی به نام ( Tripyridy-S-Triazine (TPTZ می باشد. و در حضور آنتی اکسیدان یون های فریک به فرو احیا می شود. و در حضور معرف TPTZ، محلول به رنگ بنفش در می آید. نسبت به میزان قدرت احیا کنندگی، جذب به صورت وابسته به غلظت افزایش می یابد. با استفاده از این تغییر جذب می توان خاصیت آنتی اکسیدانی ترکیبات مختلف را سنجید. افزایش جذب در طول موج 593 نانومتر پس از گذشت 10 دقیقه از شروع واکنش صورت می گیرد. برای محاسبه ی FRAP value از منحنی استاندارد سولفات آهن II استفاده شد.[Eugenija et al, 2008]
