بخشی از مقاله
مقدمه
فرآوردههایی که به صورت شیمیایی سنتز میشوند، اغلب بر محیط زیست و بدن جانداران اثرات نامطلوبی میگذارند. کاربرد فرآوردههاي طبیعی در صنایع مختلف مانند صنایع غذایی، تجاري، آرایشی، دارویی، کشاورزي و غیره امروزه بسیار مورد توجه قرار گرفته است. عوارض سوء ایجاد شده توسط داروهاي شیمیایی ازیکسو و وجود مواد مؤثره دارویی و پایین بودن سم این ترکیبات گیاهی از سوي دیگر، اهمیت گیاهان دارویی را دوچندان کرده است. بنابراین استفاده از گیاهان بهعنوان یکی از منابع مهم تجدیدشدنی، غیرقابلچشم پوشی نیست .(Guclu-Ustunda & Mazza, 2007) درمیان متابولیتهاي ثانویه ساپونینها گروهی از ترکیبات شیمیایی مهم هستند که در بسیاري از گیاهان و برخی جانوران یافت می-
شوند-(Hostettmann & Marston, 1995; Lacaille
Dubois & Wagner, 2000; Mahato & Garai, 1998; .Riguera, 1997) ساختار شیمیایی ساپونینها شامل یک هسته
هیدروفوبیک (ساپوژنین) است که توسط یک زنجیرة قندي هیدروفیل متصل به آگلیکون تريترپنی یا استروئیدي احاطه کرده است. بسته به نوع ژنین، ساپوژنینها را میتوان به سه دسته گلیکوزیدهاي تريترپنوئیدي، گلیکوزیدهاي استروئیدي و گلیکوزیدهاي آلکالوئیدي-استروئیدي تقسیم کرد. این ترکیبات با یکی از ساختارها یا هر سه ساختار در برخی گونه-هاي گیاهی یافت میشوند. اهمیت این ترکیبات به این دلیل است که تعدادي از آنها فعالیت ضدمیکروبی مؤثري دارند و اغلب در مقادیر زیاد در گیاهان سالم یافت میشوند، این مولکولها بهعنوان حفاظتکنندههاي گیاهی ضدمیکروبی
شناخته شدهاند (Osbourn, 1996a; Osbourn, 1996b;
.Price et al., 1987; Schonbeck & Schlosser, 1976)
گیاهان تیرة میخک سرشار از ترکیبات ساپونینی هستند. جنس
Silene L. با بیشاز 700 گونه، یکی از بزرگترین جنسهاي تیرة میخکیان است که اغلب در نیمکرة شمالی گسترش دارند. این جنس بیشاز 100 گونه در ایران دارد که در 21 بخش طبقهبندي میشوند (قهرمان، 1373؛ نجاتی عدالتیان، .(1389 این جنس در شرق مدیترانه، آسیاي مرکزي، ایتالیا، ترکیه، ایران، عراق، روسیه، انگلستان و اسپانیا انتشار یافته است (Biossier,
30/30 Nova Biologica Reperta 1 (2): 29-39 ( 2015)
1884; Anzalone, 1982; Davis, 1967; Komarov,
1936; Melzheimer, 1988; Tutin, 1964; Zohary, .1966) آنها گیاهانی علفی یکساله یا چندساله و پایا، گاهی در
پایه چوبی، با کاسه لولهاي، فشرده یا در بالا وسیع و گشاده، مجهز به رگبرگهاي برجسته و داراي پنج دندانه هستند. گلبرگهاي جام آنها پنج عدد، با ناخنک، بدون زاویه و گلوي آنها داراي تاجی از فلسهاست. پرچمها ده عدد، خامه سه عدد و کپسول در پایین داراي سهخانه یا فقط یکخانه، در انتها داراي شش دندانه محتوي دانههاي متعدد و پوشیده از برجستگیهاي غدهايشکل است (قهرمان، .(1373
گیاهان این جنس به دلیل داشتن ecdysteroids, phyto-ecdysteroids، ساپونین و تريترپنوئیدها حائز اهمیت هستند
.(Meng, 2001; Jurgens et al ., 2002) هدف این مطالعه بررسی کمی و کیفی محتواي ساپونین در بخشهاي هوایی و ریشه سه گونه از جنس S. swertiifolia Boiss., Silene L.
S. spergulifolia (Willd.) M. Bieb., S. gynodioica
Ghaz. subsp. penducularis (Fenzl ex Boiss.)
Melzh. است.
مواد و روشها
مواد گیاهی
سه گونه از جنس S. swertiifolia Boiss., S. ) Silene L.
spergulifolia (Willd.) M. Bieb., S . gynodioica
Ghaz. subsp. penducularis (Fenzl ex Boiss.)
Melzh. از استانهاي آذربایجان شرقی، اردبیل و خراسان جمعآوري شدند و پساز انتقال به هرباریوم دانشکدة علوم دانشگاه بوعلی سینا، با استفاده از منابعی مانند فلورا ایرانیکا شناسایی شدند (جدول .(1 بخشهاي هوایی و ریشه گونههاي تحت مطالعه، در دماي اتاق و در سایه خشک شدند و در مطالعات بعدي ازآنها استفاده شد.
تعیین اندیس کفکنندگی ساپونینها
100 میلیگرم از نمونه گیاهی پودرشده در 10 میلیلیتر آب جوش حل شد و به مدت 30 دقیقه در حمام آب جوش حرارت داده شد. پسازسرد شدن مخلوط حاصل صاف و از آن محلول-هایی با رقتهاي یک تا ده میلیگرم در میلیلیتر در سه تکرار
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 29-39 :2 31/31 Nova Biologica Reperta 1 (2): 29-39 ( 2015)
تهیه شد. سپس هریک از لولهها 15 ثانیه درجهت طولی ورتکس .(World Health Organization, 1998)
شد و درنهایت ارتفاع کف حاصل اندازهگیري گرفته شد
جدول -1 مشخصات گونههاي مورد مطالعه از جنس .Silene
Table 1. Chracteristics of the studied Silene species.
شماره ارتفاع (متر) محل جمعآوري گونه
ھرباریومی
٢٢٢٢٢ 1790 آذربایجان شرقی: تبریز به اهر، 85 کیلومتر به اهر S. ginodioica subsp. peduncularis
٢١٢١٨ 1800 اردبیل: خلخال S. spergulifolia
٢١٢٢٦ 1230 خراسان: بجنورد، دوراهی راز- جردگان S. swertiifolia
استخراج ساپونینهاي تريترپنوئیدي
بدینمنظور 2 گرم پودر خشک گیاهی در دستگاه سوکسله با 120 میلیلیتر اتانول 50، 70 و 100 درصد به مدت 2 ساعت عصارهگیري شد. عصارههاي حاصل تحت خلأ در دماي 80 درجه سانتیگراد تغلیظ شدند. سپس مواد ساپونینی و غیرساپونینی عصارههاي اتانولی 50 و 70 درصد در یک قیف جداکننده توسط 15 میلیلیتر دياتیلاتر و 10 میلیلیتر -n بوتانول جدا شد. درنهایت بخشهاي آبی و بوتانولی و عصارة حاصل از اتانول 100 درصد تحت خلأ تغلیظ شدند و سپس مورد سنجش قرار گرفتند .(Sun & Pan, 2006)
مطالعه کمی ساپونینها
سنجش ساپونینها براساس روش ابراهیمزاده و نیکنام صورت گرفت .(Sun & Pan, 2006) براي رسم منحنی استاندارد از ساپونین Merck بهعنوان مادة استاندارد استفاده شد و منحنی در محدودة بین صفر تا 400 میلیگرم در میلیلیتر رسم شد. از فاز نهایی عصاره 0/01 میلیلیتر از فرکشنهاي مختلف در لوله آزمایش ریخته شد و تا تبخیر کامل حلال، در آون در دماي 100 درجه سانتیگراد حرارت داده شد. پس از سرد شدن لولهها به هر یک از آنها، 5 میلیلیتر معرف وانیلین %0/7 در اسید-سولفوریک 65 درصد اضافه شد.
این معرف ناپایدار است و باید تازه تهیه شود. پساز ورتکس-کردن، لولهها در حمام آب گرم با دماي60 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت تیمار شدند. سپس واکنش به مدت 10 دقیقه در حمام آب یخ متوقف و درنهایت جذب آنها در طول موج 473 نانومتر اندازهگیري شد (Ebrahimzade & Niknam, .1998) محتواي ساپونین موجود در عصارهها با استفاده از منحنی استاندارد برآورد و برحسب درصد وزن خشک محاسبه شد.
مطالعه کیفی ساپونینها به روش کروماتوگرافی لایه نازك (TLC)
فرکشنهاي مختلف استخراجشده بر روي صفحات آلومینیومی پوشیده از یک لایه سیلیکاژل به عنوان فاز ثابت قرار داده شد و صفحاتدرون تانک کروماتوگرافی که قبلاً درون آن مخلوط آمونیاك، اتانول، -nبوتانول (10.5:2.5:7.5) بهعنوان فاز متحرك جهت اشباعشدن ریخته شده بود، قرار داده شدند .(Wagner & Bladt, 1998) جهت ظهور لکههاي ساپونینی، صفحات TLC بعد از خشکشدن با محلول سولفوریک اسید 15 درصد اسپري شدند. درنهایت صفحات چند دقیقه در آون با دماي 110 درجه سانتیگراد قرار داده شدند، تا رنگ لکهها در نور مرئی آشکار شود .(Wagner & Bladt, 1998) پساز ظهور لکهها Rf هر یک از آنها از رابطه زیر محاسبه شد:
فاصله حلال از مبدأ / فاصله لکه از مبدأ Rf =
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 29-39 :2
تحلیل آماري
سنجش مقدار کمی ساپونین با سه تکرار انجام شد. پساز اثبات وجود اختلاف معنیدار میان میانگینها به روش تحلیل واریانس یکطرفه (One-Way ANOVA)، گروهبندي آنها براساس آزمون دانکن در سطح احتمال p < 0.05 اجرا شد.
نتایج
تعیین اندیس کفکنندگی ساپونینها
با مشاهدة کف پایدار در آزمون تعیین شاخص کف-
کنندگی (World Health Organization, 1998) وجود ساپونین در بخش هوایی گونههاي مختلف Silene ثابت شد.
32/32 Nova Biologica Reperta 1 (2): 29-39 ( 2015)
ارتفاع کف در لولهها کمتر از 1 یا مساوي 1 سانتیمتر است. با افزایش حجم عصاره (غلظت عصاره)، ارتفاع کف پایدار ایجاد شده در لولهها نیز افزایش یافت. ارتفاع کف ایجادشده در لوله-هاي مربوط به ریشه گونه S. ginodioica برابر با 2/5 و در بخش هوایی برابر با 1/1 است که نشان میدهد شاخص کف-کنندگی آن در هر دو بخش بیشتر از 100 است (شکل .(1 ارتفاع کف ایجادشده در لولههاي مربوط به ریشه گونههاي S. swertiifolia و S. spergulifolia کمتر از 1، ولی ارتفاع در بخشهاي هوایی به ترتیب برابر 1 و بیشتر از 1 سانتیمتر است که نشان میدهد شاخص کفکنندگی آن بیشتر از 100 است (شکلهاي 2 و .(3
شکل -1 مقدار کف ایجادشده براساس غلظت عصاره درگونه .Silene ginodioica
Fig. 1. The amount of formed foam based on extract concentration in Silene ginodioica.
شکل -2 مقدار کف ایجادشده براساس غلظت عصاره درگونه .Silene spergulifolia
Fig. 2. The amount of formed foam based on extract concentration in Silene spergulifolia.
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 33/33 Nova Biologica Reperta 1 (2): 29- 39 (2015) 29-39 :2
شکل -3 مقدار کف ایجادشده براساس غلظت عصاره درگونه .Silene swertiifolia
Fig. 3. The amount of formed foam based on extract concentration in Silene swertiifolia.
استخراج ساپونینهاي تريترپنوئیدي
طی این روش 5 فرکشن به دست آمد. فرکشنهاي حاصل از ریشه هر سه گونه حاوي بیشترین مقادیر ساپونین در مقایسه با بخشهاي هوایی بودند. در گونه S. ginodioica بیشترین مقدار ساپونین استخراجشده از ریشه و بخشهاي هوایی مربوط به فرکشن 1 است (جدول .(2 در این گونه مقدار ساپونین کل در بخشهاي هوایی با ریشه برابر بود. در گونه S. spergulifolia محتواي ساپونین کل در ریشه ( µg/ml (4/66DW نسبت به بخشهاي هوایی (3/5 µg/ml DW) بالاتر بود. در این گونه نیز بیشترین مقدار ساپونین استخراجشده از ریشه و بخشهاي هوایی مربوط به فرکشن 1 است (جدول .(3
در گونه S. swertiifolia نیز مانند دو گونه دیگر، بیشترین مقدار ساپونین استخراجشده از ریشه و بخشهاي هوایی مربوط به فرکشن 1 میباشد (جدول .(4 در این گونه مقدار ساپونین کل در ریشه تقریباً 11 برابر بخشهاي هوایی بود. در شکل 4 مقدار ساپونین کل استخراجشده از ریشه و بخشهاي هوایی میان سه گونه مختلف Silene مقایسه شده است. همانطور که در شکل 4 مشاهده میشود، مقدار کل ساپونین استخراجشده از بخش-هاي هوایی در سه گونه Silene اختلاف معنیداري ندارد، به-
طوريکه بیشترین مقدار ساپونین کل در بخشهاي هوایی متعلق به گونه S. ginodioica و سپس گونههاي S. spergulifolia
و S. swertiifolia است. در ریشه بیشترین مقدار ساپونین کل متعلق به گونه S. swertiifolia میباشد، اما بین دو گونه S. spergulifolia و S. ginodioica اختلاف معنیداري وجود ندارد.
مطالعه کیفی ساپونینها به روش کروماتوگرافی لایه نازك (TLC)
کروماتوگرافی لایهنازك عصارهها، پنج لکه ساپونینی را در محدوده Rf = 0/11-0/36 به رنگهاي صورتی تا ارغوانی آشکار کرد. تصاویر کروماتوگرام مربوط به فرکشنهاي مختلف در شکلهاي 5 و 6 نشان داده شدهاست. در فرکشنهاي 4 و 5 از بخشهاي هوایی S. ginodioica و بخشهاي هوایی S. spergulifolia و S. swertiifolia لکه مرئی مشاهده نشد. عصارة خام حاصل از مرحله عصارهگیري واجد لکههاي غیر ساپونینی نیز بود، اما این لکهها طی بخشسازي در حلالهاي مختلف در مرحله آخر عصارهگیري حذف شدند. لکه شمارة 2 در ریشه S. spergulifolia با Rf =0/3 اصلیترین ترکیب ساپونینی بود (جدولهاي .(5-8
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 34/34 Nova Biologica Reperta 1 (2): 29- 39 (2015) 29-39 :2
جدول -2 محتواي ساپونین در ریشه و بخشهاي هوایی گونه .Silene ginodioica
Table 2. Saponin content in roots and aerial parts of Silene ginodioica.
شماره نوع فرکشن محتوای ساپونین ریشه محتوای ساپونین بخشھاي ھوایی
فرکشن
(µg/ml DW) (µg/ml DW)
اتانول 1 اتانول %50 2/23±0/15 2/23±0/11
٥٠%
2 اتانول -%50 بوتانول 1/55±0/13 1/15±0/03
اتانول 3 اتانول %70 0/6±0/15 0/62±0/03
٧٠%
4 اتانول -%70 بوتانول 0/28±0/01 0/36±0/01
اتانول 5 اتانول خالص 0/06±0/01 0/42±0/01
١٠٠%
جمع کل 4/72 4/78
اعداد (±) بیانگر انحراف معیار است.
