دانلود فایل پاورپوینت واکنش زنجیره ای پلی مراز

بخشی از پاورپوینت

--- پاورپوینت شامل تصاویر میباشد ----

اسلاید 1 :

واکنش زنجیره ای پلی مراز :

• مخترع واکنش PCR کَری مولیس (Kary Mullis) می باشد که در سال 1983 این روش را جهت تکثیر DNA معرفی کرد.
• قبل از این کشف، ساخت قطعات DNA با روش های کند و پر هزینه شیمیایی انجام می گرفت.
• به دلیل اهمیت این اختراع، کاربردهای فراوان و نقش ارزنده آن در پیشرفت علم ژنتیک و زیست شناسی مولکولی، وی جایزه نوبل شیمی را در سال 1993 دریافت کرد.

اسلاید 2 :

• واکنش PCR به طور روزمره در اکثر آزمایشگاه های تشخیصی و تحقیقاتی استفاده می شود و در موارد بسیاری مثل :
• شناسایی و جداسازی ژن ها
• کلونینگ
• طبقه بندی و شناسایی موجودات زنده
• تشخیص بیماری های ژنتیکی
• و حتی پرونده های جنایی و تعیین هویت کاربرد دارد.

اسلاید 3 :

اولین قدم در مهندسی ژنتیک جداسازی با خالص سازی DNA و RNA          می باشد. که این کار دارای مراحلی است که عبارتند از :
1) شکستن سلول

• سلول های حیوانی(شوک اسمزی- سدیم دودسیل سولفات)
• سلول های گیاهی (پکتیناز و سلولاز)
• باکتری ها با توجه با گرم مثبت یا گرم منفی

2) رسوب دادن DNA  و RNA  :

• الکل سبب تجمع و رسوب ماده ژنتیکی می شود.

3) جدا کردن DNA  وRNA :

4) رسوب پروتئین ها : (استفاده از فنل و یا محلول های غلیظ نمک های مختلف)

5) جداسازی DNA  و RNA  از یکدیگر: (استفاده از DNase و RNase)

6)رسوب ماده ژنتیکی با اتر    

7) اسپکتروفتومتری:(جهت تایید استخراج)

اسلاید 4 :

PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction)

• تکنیکی است که با استفاده از آن می توان در مدت زمان کوتاهی قطعه خاصی از مولکول DNA را در شرایط آزمایشگاهی میلیون ها بار تکثیر نمود.
• این قطعه DNA ممکن است:
• یک ژن
• بخشی از یک کروموزوم
• یا بخش هایی از ژنوم یک موجود باشد.

اسلاید 5 :

• اساس این روش بسیار ساده بوده و مانند واکنش همانندسازی DNA در موجودات زنده توسط آنزیم DNA پلیمراز صورت می گیرد.
• در موجودات زنده، مجموعه ای از چند پروتئین و آنزیم در فرآیند همانند سازی DNA نقش دارند در حالی که در واکنش PCR تنها نوع خاصی آنزیم DNA پلیمراز مقاوم به حرارت به نام Taq polymerase به همراه بافر، کلرید منیزیم و نوکلئوتیدها جهت تکثیر قطعات DNA استفاده می شود.

اسلاید 6 :

سازوکار (برنامه) واکنش PCR

• اساس واکنش PCR جهت تکثیر توالی DNA دو رشته ای، تغییرات دمایی می باشد. در ابتدا پیوندهای هیدروژنی دو رشته توالی DNA با حرارت (94-95 درجه سلسیوس) شکسته و دو رشته از یکدیگر جدا می شوند.
• سپس دمای واکنش پایین آورده می شود (معمولاً 50 تا 60 درجه سلسیوس). در این مرحله، دو قطعه کوتاه DNA تک رشته ای (معمولاً بین 18 تا 30 نوکلئوتید) که دقیقاً مشابه دو طرف قطعه DNA مورد نظر برای تکثیر طراحی و ساخته شده اند (با نام پرایمر یا آغازگر)، به توالی های مکمل خود در دو رشته باز شده DNA متصل می گردند. این دو قطعه انتهای 3’ آزاد جهت فعالیت آنزیم DNA پلیمراز را فراهم می نماید، کاری که در همانند سازی در موجودات زنده توسط آنزیم پریماز و توالی اولیه ساخته شده توسط آن انجام می گیرد.
• در مرحله بعد، دمای واکنش تا 72 درجه سلسیوس (دمای مناسب آنزیم Taq polymerase) افزایش یافته و عمل تکثیر قطعه DNA مورد نظر بین دو پرایمر با استفاده از نوکلئوتیدهای موجود، توسط آنزیم Taq polymerase مقاوم به حرارت انجام می پذیرد.

اسلاید 7 :

• مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیه
• عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNA
• مرحله دوم: اتصال (Annealing)، 30 تا 60 ثانیه
• عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA
• مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه
• عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر
• این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

اسلاید 8 :

در یک واکنش PCR از:

• نمونه DNA
• آنزیم Taq polymerase
• پرایمرها (0.1 – 2.0 μM)
• بافر
• یون منیزیم ( (1 – 5 mM
• نوکلئوتیدها (20 –250 μM)
• آب نوکلئاز فری

اسلاید 9 :

نمونه DNA (الگو)

• < 0.1 ng plasmid DNA, 50 ng to 1 μg gDNA for single copy genes
• قطعه ای از DNA
• محصول استخراج DNA ژنومی
• DNA پلاسمیدی
• یا حتی محصول PCR از یک واکنش دیگر

اسلاید 10 :

• معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است.
• بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر)می شود .
• مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد.
• کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد.
• همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.