بخشی از مقاله
خلاصه مقاله:
ویروس کوتولگی گندم - WDV - و ویروس کوتولگی جو - BDV - از جنس Mastrevirus و تیره Geminiviridae از عوامل مهم بیماري هاي کوتولگی و زردي در گندم و جو می باشند. BDV بطور طبیعی تنها از جو جدا شده است اما WDV علاوه بر گندم قادر به ایجاد بیماري در تعداد دیگري از غلات از جمله جو بوده است.
تاکنون تفکیک این دو ویروس بر اساس تعیین ترادف ژنوم ویروس و مقایسه آن ها با اطلاعات موجود در بانک ژن صورت می گرفت. در این تحقیق از طریق همردیف سازي ترادف نوکلئوتیدي ژنوم این ویروس ها مشخص گردید انتهايَ5ژن در آن ها داراي اختلاف فاحشی می باشد به این صورت که تمام جدایه هاي WDV حاوي یک ترادف 12 نوکلئوتیدي در این ناحیه می باشند که در جدایه هاي BDV وجود ندارد.
بر این اساس یک آغازگر 25 نوکلئوتیدي AGCGAGWCDTTCATCAACTACTCG-3' - َ- - 5' که روي رشته مکمل ویروسی قرار داشته و حاوي این 12 نوکلئوتید در انتهايَ3خود بود طراحی گردید. این آغازگر بسیار اختصاصی عمل نمود و همراه با آغازگرهاي 5'-CTCGAGTGGATCTGATTACCTGC-3' و 5'-CTACGGCGTTTGATGTTGATAGTG-3' که روي رشته ویروسی قرار دارند تنها قادر به تکثیر قطعاتی از ژنوم WDV به اندازه هاي600 و 300 جفت باز بود. در حالیکه آغازگر هاي طراحی شده از نواحی دیگر ژنوم اختصاصی عمل ننموده و قادر به تکثیر هر دو ویروس بودند.
این روش براي بررسی وقوع دو ماسترویروس در استان فارس استفاده شد، نتایج حاصله نشان داد که آلودگی نمونه هاي گندم و جو جمع آوري شده به BDV بیش تر از WDV می باشد. این روش به عنوان روشی سریع، دقیق و مقرون به صرفه در تفکیک این دو ویروس از هم معرفی می گردد.
مقدمه:
بیماري کوتولگی گندم براي اولین بار در سال 1961 توسط واکی از کشور جمهوري چک گزارش گردید . - 2 - در ناحیه بین ژنی بزرگ یک ترادف تکراري معکوس وجود دارد که تشکیل ساختمان مو گیره اي داده و شامل موتیف 9 نوکلئوتیدي 5´-TAATATTAC-3´ و محل برش T↓AC در قسمت حلقه می باشد. این موتیف در تمام جمینی ویروس ها بطور ثابت وجود دارد. ژنوم یک بخشی ماسترویروس ها حاوي چهار چارچوب ژنی است و به طریق دایره غلتان تکثیر می یابد
بررسی ها نشان می دهد که این ویروس ها، یکی از عوامل اصلی کمپلکس زردي در مزارع غلات ایران هستند. به همین دلیل به نظر می رسد که ارتباط دادن تمام کوتولگی و زردي هاي موجود در سطح مزارع ایران به BYDV تصور نادرستی باشد و باید نقش ویروس هاي دیگر همچون WDV و BDV را نیز در ایجاد این گونه علایم در نظر گرفت.
در مطالعاتی که Wu و همکاران - 5 - ، روي 28 ترادف کامل این ویروس ها در چین انجام دادند، جدایه هاي آلوده کننده گندم، جو و یولاف را به عنوان گونه هاي مجزا در نظر گرفتند و به ترتیب نام هاي WDV، BDV و ODV را براي آن ها پیشنهاد نمودند. لازم به ذکر است که هر دو گروه ذکر شده، بیشترین میزان تفاوت بین گونه ها را در نواحی RepA، SIR و LIR و اینترون موجود در ناحیه چارچوب هاي ژنی C1 و C2 گزارش نمودند
مواد و روش ها:
استخراج دي. ان. اي از بافت گیاهی به روشی که توسط بهجت نیا و همکاران - 1 - توضیح داده شده، انجام شد. از آزمون واکنش زنجیره اي پلیمراز براي تکثیر ژنوم ویروس طبق برنامه دمایی جدول شماره 1 و استفاده از آن در آزمایشات همسانه سازي و تعیین ترادف ژنوم ویروس و همچنین ردیابی و شناسایی ویروس در نمونه هاي داراي آلودگی طبیعی به بیماري زردي و کوتولگی مزارع گندم و جو استفاده شد - تصویر شماره . - 1 مقایسه ترادف هاي ماسترویروس هاي کوتولگی گندم و جو با سایر ماسترویروس هاي موجود در GenBank انجام شد
جدول شماره :1 سیکل دمایی آزمون واکنش زنجیره اي پلیمراز
تصویر :1 نقوش الکتروفورزي محصول PCR تکثیر شده با جفت آغازگر p2311C/p2312V ماسترویروس هاي کوتولگی گندم و جو. راهک -1 گیاه جو آلوده متعلق به منطقه رباط میاندشت، راهک -2 مارکر، راهک 3 و -4 گاهی جو آلوده منطقه جلگه رخ استان خراسان.
بحث و نتیجه گیري:
بررسی ها نشان داد ترادف نوکلئوتیدي و آمینو اسیدي ژن رمز گذار پروتئین Rep ویروس کوتولگی جو ایران به ترتیب متشکل 1044 جفت باز و 347 آمینو اسید می باشد. این جدایه بر اساس ترادف آمینواسیدي در حدود 93/4 تا96/3 درصد با سایر جدایه هاي BDV دنیا همسانی و مشابهت دارد در حالی که در رابطه باجدایه هاي دیگر WDV و ODV دنیا این عدد به ترتیب در حدود 92/8 تا 94/2 و 72/9 می باشد. بر اساس نتایج حاصل از تجزیه تحلیل هاي صورت گرفته بر روي ژن رمز کننده پروتئین Rep ، BDV-Ir در کنار سایر جدایه هاي جو ماسترویروس هاي کوتولگی گندم و جو قرار نمی گیرد بلکه در کنار جدایه هاي گندم WDV قرار می گیرد.
این مطلب می تواند مبین وقوع نوترکیبی بین ژنی در این ویروس ها باشد. همردیف سازي ترادف آمینواسیدي انتهاي کربوکسیلی پروتئین Rep ویروس کوتولگی جو ایران - BDV-Ir - و مقایسه آن با جدایه هاي WDV و BDV از سایر نقاط دنیا اشاره به موقعیت بسیار حفاظت شده در تمام جدایه هاي ویروس کوتولگی گندم - WDV - می باشد.
لازم به ذکر است که چهار آمینواسید مشخص شده با در تصویر شماره 2، در جدایه هاي ویروس کوتولگی گندم - BDV - وجود ندارد. هر دو گونه BDV و WDV داراي ترادف نوکلئوتیدي مشابهی در پروتئین RepA و از طرفی داراي بیشترین میزان اختلاف و تنوع در نواحی بین ژنی کوچک و بزرگ می باشند. بنابراین مقایسه ترادف نوکلئوتیدي این نواحی براي مطالعات فیلوژنیک جدایه هاي بسیار نزدیک مناسب می باشند
تصویر شماره :2 همردیف سازي ترادف آمینواسیدي انتهاي کربوکسیلی پروتئین Rep جدایه جو ویروس کوتولگی گندم ایران - BDV-Ir - و مقایسه آن با جدایه هاي WDV و BDV از سایر نقاط دنیا. نقطه - . - به معناي مشابهت با ترادف بالاي آن می باشد . اشاره به موقعیت بسیار حفاظت شده در تمام جدایه هاي گندم ویروس کوتولگی گندم - WDV - می باشد. لازم به ذکر است که چهار آمینواسید مشخص شده با در جدایه هاي جو ویروس کوتولگی گندم - BDV - وجود ندارد.
مشابه سایر جمینی ویروس ها ناحیه بین ژنی جدایه جو ویروس کوتولگی گندم ایران، حاوي ترادف هاي نوکلئوتیدي کوتاه تکراري می باشد. ترادف CCACGCAGG موجود در رشته سنس ویریون در موقعیت نوکلئوتیدي -2722 2714، در رشته سنس مکمل در موقعیت هاي 3-11 و 2568-2576 از ژنوم BDV-IR تکرار شده است. این نحوه و ترتیب قرار گرفتن ترادف هاي تکراري به عنوان جایگاه احتمالی اتصال Rep مشابه آنچه که در مورد سایر ماسترویروس ها پیش بینی شده است می باشد.
ترادف CCACGCAGG در تمام جدایه هاي BDV که شامل جدایه هاي ترکیه، سوئد، آلمان و ایران می باشد، وجود دارد در حالی که عنصر تکرار جایگاه اتصال Rep در تمام جدایه هاي گندم WDV ترادف CCACGCGGG می باشد که در آن G جایگزین نوکلئوتید A در موقعیت شماره 7 جدایه هاي جو شده است. پروتئین Rep هر جمینی ویروس به طور اختصاصی تنها به موتیف هاي اتصال Rep خود اتصال می یابد و مشخص شده که حتی تغییر یک نوکلئوتید در جایگاه اتصال Rep منجر به نا کار آمدي Rep در همانندسازي ژنوم واریانت هاي نزدیک به هم خواهد شد.
