بخشی از مقاله
چکیده
پیشرفت هاي اخیر در صنعت و افزایش سرعت شهر نشینی، منابع انرژي پایدار را می طلبد. اتانول ساخته شده از بیو مس توسط میکرو ارگانیزم ها یکی از استراتژي هاي بی نظیر و سود مند از لحاظ اقتصادي و محیطی است و میتواند به عنوان یک سوخت پاك، ایمن و جایگزین براي سوختهاي فسیلی مورد ملاحظه و بررسی قرار گیرد. در مسیر تولید بیو اتانول از مسیر امبدن مایرهوف، پیرووات دکربوکسیلاز - pdc - یک آنزیم کلیدي در همه تخمیرهاي اتانولی می باشد. اگرچه این ژن به صورت گسترده در گیاهان، مخمرها و قارچها توزیع شده است ولی در حیوانات وجود ندارد و نیز در تعداد کمی از باکتري ها - به صورت محرز در سه میکروارگانیزم - موجود می باشد.
این آنزیم دکربوکسیلاسیون غیر اکسیداتیو پیروات به استالدهید را با استفاده ازیون Mg2+ و تیامین پیروفسفات به عنوان کوفاکتور، کاتالیز می کند.سپس استالدهید تولید شده توسط ژن الکل دهیدروژناز - ADH - در طول اکسیداسیون NADH به اتانول تبدیل می شود. هدف از این تحقیق جداسازي این ژن - - pdc از باکتري Zymomonas mobilis از طریق طراحی پرایمر - با استفاذه از نرم افزار هاي VectorNTIو - OLIGO 6 و با استفاده از واکنش زنجیره اي پلیمراز بود.که ژن مورد نظر با موفقیت جداسازي و باند مورد نظر مشاهده گردید. این ژن حاوي جایگاه هاي برشی Sal I و Xho I درابتدا و انتهاي خود می باشد که میتواند در انواع حامل هاي بیانی باکتریایی قرار گرفته و موجب افزایش بیان ژن گردد.
کلمات کلیدي: بیواتانول، طراحی پرایمر، واکنش زنجیره اي پلیمراز، ژن پیروات دکربوکسیلاز
مقدمه
پیشرفت هاي اخیر در صنعت و افزایش سرعت شهر نشینی، منابع انرژي پایدار را می طلبد. اتانول ساخته شده از بیو مس یکی از استراتژي هاي بی نظیر و سود مند از لحاظ اقتصادي و محیطی است و میتواند به عنوان یک سوخت پاك، ایمن و جایگزین براي سوختهاي فسیلی مورد ملاحظه و بررسی قرار گیرد. در سراسر جهان مقدار زیادي از بیو مس هاي لیگنوسلولزي موجود است که می تواند به منظور استخراج و تولید بیو اتانول مورد استفاده قرار گیرد. اخیرا پیشرفت هاي قابل ملاحظه اي در تولید بیو اتانول از مواد لیگنوسلولزي بوجود آمده است. به هر حال وجود موانع اقتصادي و تکنیکی مانع از پیشبرد موفقیت آمیز برنامه تولید بیو اتانول در سطح تجاري شده است. عصر حاضر نه تنها اهمیت انرژي هاي جایگزین را به دلیل محدودیت انرژي فسیلی می داند بلکه به دنبال انرژي هاي پاك و ایمن می باشد.
نقصان جهانی انرژي، علاقه دولتمردان جهت افزایش سوخت هاي جایگزین را به خود جلب کرده است . - 1 - در طول دو دهه اخیر پیشرفت هایی در تکنولوژي تولید اتانول از بیومس بهبود یافته است تا اینکه تولید در مقیاس صنعتی در چند سال آینده مقدور خواهد شد - . - 7 عملکرد اتانول و فرایند اقتصادي همراه با پیشرفتهاي تکنیکی و فواید محیطی با استفاده از اتانول پارامترهاي کلیدي در تولید اتانول میباشد . - 4 - مصرف سوختهاي فسیلی در عصر حاضر باعث بحران زیست محیطی شده است. استفاده از سوختهاي فسیلی باعث تولید دي اکسید کربن و متان و مقدار قابل ملاحظه اي اکسید نیتروژن میگردد. بیشتر خطر این گازها بخاطر سوختن ناقص این گازها میباشد در حالیکه اتانول شامل %35اکسیژن میباشد که ممکن است در نتیجه سوختن کامل بدست آید و بنابرین باعث کاهش آلودگی می شود. به علاوه انرژي بیومس میتواند نقش مهمی در کاهش گازهاي گلخانه اي بازي کند. بیو اتانول به عنوان منبع انرژي تجدید پذیر میباشد. از اینرو دي اکسید کربن به اتمسفر اضافه نمی شود. - . - 2
پیشرفت تولید اتانول به عنوان سوخت نیازمند پیشرفت تکنیکهایی در جهت افزایش تولید آن از طریق مهندسی ژنتیک و مهندسی متابولیت سویه هاي میکروبی می باشد. قابل ذکر است که اکثر باکتري ها و میکرو ارگانیسم هاي تولید کننده بیو اتانول قادر به تخمیر مستقیم منابع سلولزينمی باشند به همین خاطر پیش تیمارهاي آنزیمی و یا اسیدي جهت تبدیل سلولز به قندهاي ساده ضروري می باشد ولی در سویه هاي مهندسی شده که قادر به تخمیر سلولز می باشند این مرحله می تواند حذف شود. همه مونو ساکارید ها در مسیر امبدن مایرهوف - شکل- - 1به ماده حد واسط مهم پیروات تبدیل می شوند . - 6 -
به نظر میرسد یکی از مهمترین مشکلات در بیوسنتز اتانول از مواد زیستی محدودیت عملکرد آنزیمهاي درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول باشد این آنزیمها - شکل- - 1 در تبدیل مواد اولیه به محصول نهایی در باکتري نقش اساسی دارند. با توجه به بررسی منابع و نیز بررسی فرآیند تولید به نظر میرسد افزایش بیان - Over Expression - ژن پیروات دکربوکسیلاز - pdc - تحت کنترل پروموتورهاي قوي منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد گردید.محصول ژن پیروات دکربوکسیلاز - آنزیم - pdc، نقش کلیدي در مسیر تولید بیواتانول را داراست و در تغییر مسیر مصرف پیرووات به سمت تولید بیواتانول مهمترین آنزیم می باشد به همین منظور در این مطالعه ژن پیرووات دکربوکسیلاز از باکتري Zymomonas mobilis از طریق PCR - واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز - جداسازي و تکثیر گردید.
مواد و روش کار
شناسایی توالی ژن مورد نظر - pdc - در بانکهاي اطلاعاتی بویژه : NCBI در این مرحله با بررسی توالیهاي موجود در بانکهاي اطلاعاتی، توالی صحیح مربوطه در انواع میزبانهاي مختلف شناسایی و در نهایت پس از BLAST توالی مورد نظر با سایر توالیها و بررسی جایگاه-هاي برشی، توالی مورد نظر جهت طراحی آغازگر و جداسازي در شرایط in vitro انتخاب گردید.
طراحی آغازگرهاي - Primer - مناسب:
در این مرحله بر اساس الگوي توالی مورد نظر انتخاب شده از بانکهاي اطلاعاتی، با استفاده از نرم-افزار OLIGO6 و Vector NTI آغازگرهاي مناسب جهت جداسازي ژن PDC طراحی گردید PDC Forward Primer: 5ʹGTCGACATGAGTTATACTGTCGGTAC3ʹ PDC Reverse Primer: 5ʹCTCGAGCTAGAGGAGCTTGTTAACAG3ʹ کلونی PCR و بهینه سازي شرایط PCR جهت جداسازي ژن مورد نظر: ابتدا مخلوط واکنش PCR به میزان 50 مایکرولیترطبق پروتکل زیر تهیه گردید. سپس از تک کلونی هاي رشد کرده Zymomonas mobilis بر روي محیط جامد به میزان مناسب به تیوب هاي PCR حاوي اجزاي واکنش اضافه گردید.با توجه به اینکه Tm - دماي ذوب - دو پرایمر Forward و Reverse نزدیک به هم بودند متوسط دماي آنها یعنی 56 درجه سانتی گراد انتخاب و 2درجه پایینتر از آن - 54درجه سانتی گراد - به عنوان دماي اتصال - Annealling - اولیه انتخاب و پروفیل هاي دمایی مختلف براي دماهاي بالاتر و پایینتر از آن جهت مشاهده نتیجه بهتر اعمال گردید.
