بخشی از مقاله
چکیده
جاروک و لکه سبز مرکبات که توسط Candidatus Phytoplasma aurantifolia و Candidatus Liberibacter به وجود میآیند از مخربترین عوامل بیماریزا در جنوب ایران بهشمار میروند. درحال حاضر هیچ روشی برای کنترل این بیماریها معرفی نشده است. بنابراین روشهای قرنطینهای از جمله تشخیص زودهنگام درختان آلوده و امحاء آنها بسیار مهم میباشد. بدین منظور یافتن روش تشخیصی مطمئن و حساس اولین گام برای جلوگیری از انتقال آلودگی به سایر نقاط توصیه میشود. روشهای ردیابی زیستی عوامل بیماریزا وقتگیر بوده و نیازمند استفاده از ارقام محک است. واکنش زنجیرهای پلیمراز یک روش قدرتمند برای تشخیص مولکولی پاتوژنهاست.
حساسیت و قدرت تشخیص بالا، از جمله مزیتهای این تکنیک برای شناسایی عوامل بیماریزا است. روش Simplex PCR در هر واکنش تنها قادر به شناسایی یک پاتوژن است، در حالیکه روش Multiplex PCR قادر است در یک واکنش آلودگی به چند پاتوژن را شناسایی کند. در این تحقیق از پرایمر A2/J5 برای شناسائی HLB و از پرایمر IMP.PET28 برای تشخیص WBDL استفاده شد. پس از الکتروفورز یک قطعه 703 جفت بازی در نتیجه تکثیر گرینینگ با پرایمر A2/J5 و یک قطعه 519 جفت بازی در اثر تکثیر جاروک با پرایمر IMP.PET28 در ژل آگاروز ظاهر گردید. همچنین در اثر تکثیر با هر دو جفت پرایمر، هر دو قطعه 703 و 519 جفت بازی در ژل آگاروز مشاهده شد. این روش در تولید گیاهان عاری از آلودگی و تشخیص سریع آلودگی برای برنامه های گواهی دهی نهال ها بسیار مفید می باشد.
واژه های کلیدی:جاروک، گرینینگ، Multiplex PCR
مقدمه
کشت مرکبات در ایران سابقه طولانی دارد. در ابتدا مرکبات به صورت بذری تکثیر میشد، اما امروزه بیشتر واریتههای مرکبات روی انواع پایهها پیوند زده میشوند. استفاده از پایههای مناسب، بر روی عملکرد و کیفیت میوه و مقاومت پیوندک به سرما، آفات و بیماریها مؤثر است . - 1 - به طور کلی بیش از صد رقم مختلف مرکبات در طی سالهای 1316-1375 وارد ایران شد. این ارقام که از آمریکا، مصر، هند، لبنان، مراکش، فلسطین، ترکیه و اتحاد جماهیر شوروی سابق وارد کشور شده بودند، به احتمال زیاد به یک یا چند ویروس یا ویروئید آلوده بودند . - 2 - مرکبات میزبان تعدادی از بیماریهای ویروسی و باکتریایی است که عمدتاً از طریق پیوندک آلوده منتقل میشوند - 3،4،5،. - 6 بیماریهای گرینینگ و جاروک از جمله مهمترین بیماریهای مرکبات محسوب میشوند. بیماری گرینینگ ناشی از باکتریهای آوندی جنس Candidatus Liberibacter، مخربترین بیماری مرکبات بوده و گسترش آن کشت و کار مرکبات را در مناطق آلوده دنیا تحت الشعاع قرار داده است.
عمده ارقام مرکبات، به این بیماری حساسند. متأسفانه بیماری از تعدادی از استانهای کشور از جمله سیستان و بلوچستان، هرمزگان و اخیرا از کرمان گزارش شده است. بیماری جاروک - Witches Broom - disease لیموترش ناشی از Candidatus Phytoplasma aurantifolia، نوعی بیماری شبه ویروسی مایکوپلاسمایی است که از طریق مواد گیاهی آلوده و زنجرک - Hishimon usphycitis - منتقل شده و در مدت کوتاهی باعث زوال درختان میگردد . - 6 - بطوری کلی به منظور بررسی سالم بودن مواد گیاهی، از روشهای تشخیصی خاص و حساس استفاده میشود تا از گسترش عوامل بیماری زا جلوگیری گردد - . - 7 روش های ردیابی زیستی عوامل بیماریزا وقت گیر بوده و نیازمند استفاده از ارقام محک است . - 8 - آزمون الایزا برای تشخیص آلودگیهای ساده ویروسی استفاده میشود
و تا حد زیادی توانسته جایگزین روش های تلقیح از طریق پیوندک شود - ELISA . - 9 یک روش تشخیصی مؤثر، قوی و پرکاربرد برای تعداد زیادی از نمونههاست. با این حال، دارای مشکلات زیادی است که تشخیص ویروس را محدود میکند . - 10 - الایزا و انواع مختلف آن نیازمند استفاده از آنتی سرم با کیفیت بالا هستند که به آسانی برای همه ویروسهای مرکبات در دسترس نیست. همچنین نمیتواند گونههای نزدیک به هم را از هم تفکیک نماید - 11 - و در حجم کم رخ می دهد . - 8 - واکنش زنجیرهای پلیمراز یک روش قدرتمند برای تشخیص مولکولی پاتوژنهاست. حساسیت و قدرت تشخیص بالا، از جمله مزیت های این تکنیک برای شناسایی عوامل بیماری زا است. روشهای simplex PCR در هر واکنش تنها قادر به شناسایی یک پاتوژن هستند. در حالیکه روش multiplex PCR قادر است با یک واکنش آلودگی با تعدادی از پاتوژنهای دارای ژنوم DNA و RNA را شناسایی کند . - 12 -
مواد و روش نمونه گیاهی
نمونه های گیاهی آلوده،از درخت اتراک آلوده به گرینینگ و نهال لایم آلوده به جاروک که قبلاً از طریق پیوند به این پاتوژن ها آلوده شده بودند تهیه شد. این درختان در گلخانه قرنطینه پژوهشکده مرکبات و میوه های نیمه گرمسیری رامسر نگهداری می شوند. به منظور تهیه نمونههای کنترل منفی نیز از 2 گیاه سالم نمونه برداری صورت گرفت.
استخراج DNA
نیم گرم از بافت رگبرگ و پوست نازک ساقه با ازت مایع در هاون پودر شد. استخراج DNA با استفاده از روش - 13 - CTAB با اندکی تغییرات انجام شد. به پودر حاصل 3 میلی لیتر بافر [CTAB 2%, Tris-HCl 2M, CTAB EDTA 0.5M, NaCl 5M, PVP2%] به همراه مرکاپتواتانول 0/2 درصد اضافه و مخلوط گردید تا عصاره یکنواختی به دست آید. مخلوط حاصل به مدت 15 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد نگهداری شد. در طی این مدت، ویال حاوی مخلوط چند بار سر و ته گردید. سپس به مدت 5 دقیقه با سرعت 13000rpm سانتریفیوژ شد. فاز رویی به تیوپ 2 میلی لیتری جدید منتقل و کلروفرم:ایزوآمیل الکل با نسبت 1:24 اضافه شد. پس از مخلوط کردن اجزاء، سانترفیوژ به مدت 5 دقیقه با سرعت 14000rpm یا 10 دقیقه با سرعت 13000rpm انجام شد. فاز رویی به تیوپ 1/5 میلی لیتری جدید منتقل و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه و مخلوط گردید. پس از نگهداری تیوپ به مدت یک شبانه روز در دمای -20 درجه سانتیگراد، سانتریفیوژ به مدت 25 دقیقه با سرعت 13000rpm صورت گرفت. فاز رویی خارج شده و شستشوی رسوب با اتانول 70 درصد انجام شد. رسوب حاصل در دمای اتاق خشک شده و در50 میکرولیتر آب مقطر استریل حل گردید.
انتخاب پرایمر
پرایمرهای مورد استفاده در این آزمایش بر اساس توالی HLB با شماره دسترسی M94319 و توالی WBDL با شماره دسترسی GU339497.1 موجود در بانک ژن انتخاب شد - جدول . - 1
واکنش زنجیره ای پلیمراز واحد - simplex PCR -
واکنش زنجیره ای پلیمراز واحد، برای 2 پاتوژن جاروک و گرینینگ و 2 نمونه کنترل منفی صورت گرفت. واکنش در حجم 10 میکرولیتر شامل 100 نانوگرم DNA الگو، 6 میکرولیتر مسترمیکس - یکتا تجهیز آزما - ، 0/3 میلی مولار هر کدام از پرایمرهای F و R انجام شد. برای نشان دادن برهم کنش بین جفت پرایمرها، در تیوپ شماره 2 حاوی نمونه HLB، به جای یک میکرولیتر آب، از یک میکرولیتر جفت پرایمر - F&R - جاروک هم استفاده شد.
واکنش زنجیره ای پلیمراز 2گانه - Douplex PCR -
واکنش PCR دوگانه نیز در حجم 10 میکرولیتر شامل 50 نانوگرم هر پاتوژن، 6 میکرولیتر مسترمیکس و 0/25 میلی مولار از هر کدام از جفت آغازگرها - مربوط به هر دو پاتوژن - انجام شد. شرایط دمایی و زمانی PCR شامل یک
