بخشی از مقاله
چکیده
تب کیو بیماری تبدار ریکتزیائی است که ممکن است با نشانههای ناگهانی مانند لرز، درد پشت چشم، ضعف، کسالت و تعریق شدید تظاهر نماید. با توجه به اینکه این باکتری در دامها شایع هست و امکان انتقال این باکتری از طریق شیرهای آلوده وجود دارد، این مطالعه با هدف تعیین میزان شیوع کوکسیلا بورنتی در نمونه هائ شیر خام جمعآوری شده از گاوهای شیری عجب شیر انجام گردید. این مطالعه از اردیبهشت ماه 1393 تا آبان 1393 انجام شد.
در مجموع 80 نمونه شیر از 8 مجتمع پروش گاو شیری شهرستان عجبشیر جمعآوری و از نظر حضور کوکسیلا بورنتی به روش Nested-PCR مورد آزمایش قرار گرفتند. در این مطالعه در مجموع 20 نمونه از 80 نمونه شیر - 25 درصد - از نظر کوکسیلا بورنتی مثبت بودند. با توجه به اهمیت باکتری کوکسیلا بورنتی، تشخیص سریع و دقیق آن بسیار حائز اهمیت است. تکنیکهای مولکولی به علت دقت بالا و سرعت زیاد در روند تشخیص میتواند بسیار موثر باشند. لذا بومی سازی تکنیکهای مولکولی در کشور جهت تشخیصی عامل تب کیو توصیه میشود. نتایج این پژوهش نشان داد که شیر گاو میتواند یکی از مخازن بالقوه کوکسیلا بورنتی در ایران باشد.
مقدمه
عامل بیماری، کوکسیلا بورنتی که در خانواده ریکتزیاسه قرار دارد، کوکوباسیل پلئومرفیک، گرم منفی و داخل سلولی اجباری با اندازه در حدود 0/3 تا 0/7 نانومتری .[1.2] بعضی از جنبه های همه گیری شناختی این بیماری ممکن است از کشوری به کشور دیگر متفاوت باشد به طوری که در کانادا بیشتر به شکل پنومونی و در فرانسه به صورت هپاتیت تظاهر مینماید و در اسپانیا هر دو حالت بیماری شایع است و تفاوت چهره های بالینی بیماری، انعکاسی از نحوه انتقال کوکسیلا بورنتی میباشد به طوری که مصرف شیر آلوده بیشتر منجر به هپاتیت و استنشاق افشانههای آلوده بیشتر باعث ایجاد پنومونی میشود.
[3.4] هرچند این بیماری در بیشتر نقاط دنیا گزارش شده است، ولی میزان بروز واقعی آن به دلیل خفیف بودن نشانههای بالینی بسیاری از موارد آن و مشکلات تشخیص بالینی و آزمایشگاهی، کمتر از موارد گزارش شده است. بیماری در بعضی از نواحی که مخازن حیوانی آن وجود دارد به صورت بومی شایع بوده و دامپزشکان، کارکنان صنایع گوشت، گوسفند داران و گاهی کارکنان صنایع شیر و کشاورزان را آلوده میکند .[4.5] از آنجا که تا به امروز مطالعهای در مورد تب کیو در منطقه مورد نظر انجام نشده بوده و همچنین در مورد نقش گاو در پراکنده کردن کوکسیلا بورنتی در منطقه اطلاعاتی در دست نبوده و با توجه به اهمیت موضوع برای احتمال آلودگی انسان، مطالعهی حاضر با هدف جستجوی ژنومی کوکسیلا بورنتی در شیر گاو به روش واکنش زنجیرهای پلیمراز آشیانهای - Nested PCR - در شهر عجب شیر انجام گرفت.
مواد و روش کار
شهرستان عجبشیر با وسعت 738 کیلومتر مربع 1.6 - درصد مساحت استان - در 100 کیلومتری تبریز واقع شده، این شهرستان در منطقه کوهستانی واقع شده و دارای تابستانهای معتدل و زمستانهای سرد و برفی میباشد . - 7 - به منظور ردیابی کوکسیلا بورنتی در نمونه های شیر گاو، از روش Berri همکاران استفاده شد . - 8 - برای بررسی حضور DNA ژنومی کوکسیلا بورنتی در نمونهها، روش آزمون واکنش زنجیره ای پلیمراز آشیانه ای Nested- - - PCR به کار رفت.
توالی آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن com1 که کد کننده پروتئین غشای خارجی کوکسیلا بورنتی میباشد، بر اساس روش مطالعهی Zhang و همکاران - 1998 - و Fretz و همکاران - 2007 - بود . - 9.10 - برای انجام PCR در مرحله اول، غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش، در حجم نهایی 25 میکرولیتر به صورت زیر استفاده شد. مسترمیکس آماده ساخت کشور دانمارک - Ampliqon CO., Denmark - به حجم 9 میکرولیتر، DNA نمونه مشکوک به حجم 4 نانوگرم و 1 میکرومول از هر پرایمر - - OMP1-5 -AGT AGAAGC ATC CCA AGC ATT G-3 - OMP2-5 -TGC CTG CTA GCT GTA ACG ATT G-3 -501bp - با غلظت 10 پیکومول و مابقی حجم را آب مقطر اضافه و سپس همه مواد به داخل یک میکروتیوب 0/2 میلی لیتری منتقل و پس از مخلوط کردن در دستگاه ترموسایکلر - Applied Bioscience, USA - قرار داده شد.
برنامه دمایی به صورت 94 درجه سلسیوس 3 دقیقه، 30 چرخه دمایی به ترتیب 94 درجه سلسیوس به مدت 45 ثانیه، 56 درجه سلسیوس به مدت 45 ثانیه æ 72 درجه سلسیوس به مدت 45 ثانیه بود و در ادامه مرحله نهایی 72 درجه سلسیوس به مدت 5 دقیقه تنظیم گردید. جهت جلوگیری از نمونههای مثبت کاذب تمام مراحل ساخت مسترمیکس در زیر هود بیولوژیک انجام شد. برای PCR مرحله دوم از پرایمرهای OMP3-5 -TTG GAA GTT ATC ACG CAG TTG-3 و - OMP4-5 -GAA GCG CAA CAA GAA GAA CAC-3 -438 bp - استفاده شد. در این بررسی، کنترل مثبت DNA ژنومی کوکسیلا بورنتی استاندارد از کیت تشخیصی تجاری - K047, Genekam - Biotechnology AG, Germany استفاده شد. دادههای حاصل، به کمک نسخهی نوزدهم نرمافزار SPSS و با نجام آزمون آماری خیدو، مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفتند. مرز معنیداری در P<0/05 قرار داده شده.
نتایج و بحث:
در این مطالعه 8 دامداری سنتی مورد مطالعه قرار گرفت، که از مجموع 80 نمونه شیر مورد مطالعه 20 نمونه 25 - درصد - در آزمون Nested PCR مثبت بودند. - شکل . - 1 شکل-1 ژل حاصل از آزمایش Nested PCR روی شیر خام گاوهای مورد مطالعه جهت شناسایی کوکسیلا بورنتی در نمونههای شیر خام شهرستان عجب شیر - ستون -L مارکر 100 جفت بازی DNA، ستونهای 5،3،2،1 نمونههای منفی، ستونهای 4 و 5 نمونههای مثبت، ستون - - - نمونه منفی و ستون - + - کنترل مثبت - . روش Nested-PCR نسبت به روشهای کلاسیک از سرعت، دقت، اختصاصیت و حساسیت بالایی برخوردار است. از جمله می توان به مطالعات ذیل اشاره کرد: کارگر و همکاران در سال 2012، روی 100 نمونهی شیر گاو در شهرستان جهرم، میزان شیوع آلودگی 11 درصد گزارش شد .
- 11 - در سال 2013، در مطالعهای توسط Khanzadi و همکاران در خراسان رضوی روی 23 نمونهی شیر گوسفند، 8 نمونه 34/78 - درصد - مثبت بود . - 12 - در سال 2013، در مطالعهی دیگری که توسط Ghlynchi و همکاران در استان قم انجام شد، 14 نمونه از مجموع 100 نمونه 14 - درصد - مثبت بود . - 13 - در سال 2014، در مطالعهای توسط Khademi و همکاران در خرمآباد روی 54 نمونهی شیر بز، 26 نمونه 48 - درصد - مثبت بود . - 14 -
در سال 1998، Lyytikainen و همکاران در آلمان، بالاترین میزان شیوع آلودگی گوسفندان به کوکسیلا بورنتی را در طول فصول زمستان و بهار گزارش کردند . - 15 - در سال 2012، Gyuranecz و همکاران، مطالعهای در کشور مجارستان روی 215 نمونه از تانکهای شیر انجام دادند که 66/7 درصد از آنها از نظر وجود کوکسیلا بورنتی مثبت بودند - . - 16 برخی مطالعات دیگر، طیفهای مختلفی از وجود کوکسیلا بورنتی را در شیر گزارش کرده-اند که به عنوان مثال در کشور ایالت باسک 22 درصد و در کشور ژاپن 17/1 درصد مثبت بودند .
- 17.18 - در سال 2011، در مطالعهای توسط عباسی و همکاران، از مجموع 296 نمونهی شیر، 12 نمونه یعنی 4/1 درصد مثبت بود - . - 19 در سال 1392، در مطالعه سرولوژیکی که توسط بروجنی و همکاران در اهواز روی گلههای گوسفند صورت گرفت، درصد شیوع سرمی تب کیو %13/18 اعلام شد که نشان دهندهی آلودگی کمتر گوسفند نسبت به بز است . - 5 - این اختلافات مشاهده شده ممکن است به علت متفاوت بودن گونهی حیوانی، محل جغرافیایی و در نتیجه، شرایط آب و هوایی مناطق و نحوهی مدیریت باشد.
نتیجه گیری
با توجه به شواهد سرولوژیکی اولیه بهدست آمده به نظر میرسد که تب کیو در حال حاضر در ایران وجود دارد و به خاطر مطالعات اندک موجود، بیماری مورد توجه قرار نمیگیرد یا با بیماریهای تبدار دیگر مثل تب مالت یا آنفلوانزا اشتباه میشود. به دلیل طبیعت زئونوزی بیماری و آلودگی احتمالی گسترده حیوانات میزبان، لازم است دستگاهها و سازمانهای مسئول دامپزشکی و زیر مجموعههای وزارت بهداشت تعامل گسترده و نزدیکی جهت شناسایی مخازن و پیشگیری و کنترل بیماری با همدیگر داشته باشند.
