بخشی از مقاله
چکیده:
در این پژوهش که از تابستان سال 1392 به مدت یک سال ادامه داشت، تعداد 200 نمونه از نمونه هاي کشت ادرار مثبت را مورد ارزیابی قرار دادیم . نمونه ها پس از انتقال به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه ایلام بوسیله تست هاي افتراقی، بیوشیمیائی و میکروب شناسی تشخیص و سویه هاي استافیلوکوکوس اورئوس بوسیله آزمایش هاي DNase ، کواگولاز بر روي لام، کشت در محیط مانیتول سالت آگار، کاتالاز و اکسیداز تائید شدند. سپس تست آنتی بیوگرام بروش دیسک دیفیوژن و همچنین تعیین میزان MIC آنها بعمل آمد، و نهایتا الگوي ژنوتیپی آنها با استفاده از پرایمرهاي طراحی شده براي تعیین ژن تولید توکسین پنتون والنتین - PVL - به روش PCR تعیین گردید . در این بررسی از تعداد 200 نمونه مورد آزمایش تعداد 29 سویه - %14/5 - استافیلوکوکوس اورئوس جدا گردید.بررسی الگوي مقاومت آنتی بیوتیکی بروش دیسک دیفوژن نشان داد که تمامی سویه ها به آنتی بیوتیک هاي تتراسیکلین، سولفومتوکسازول، پنی سیلین، جنتامایسین، توبرومایسین صددرصد مقاوم بودند و تعداد 12 سویه - %41/37 - به سفوتاکسیم حساس، تعداد 6سویه - %20/68 - به کانامایسین، تعداد17 سویه - %58/62 - به سیپروفلوکساسین، تعداد 23 سویه - %79/31 - به کلرامفنیکل، تعداد23 سویه - %79/31 - به نیتروفورانشن، تعداد 23 سویه - - %79/31 به نتیل مایسین، تعداد 16 سویه - %55/17 - به متی سیلین مقاوم و 29 سویه - %100 - به ونکومایسین حساس بودند. بررسی مولکولی ژن pvl بوسیله PCR نشان داد که تعداد 1 سویه - %4/33 - داراي ژن pvl بودند.
کلمات کلیدي: عفونت مجاري ادراري، استافیلوکوکوس، آنتی بیوگرام، الگوي مولکولی.
مقدمه:
عفونت هاي ادراري از شایع ترین بیماري هاي عفونی محسوب شده و بعد از عفونتهاي دستگاه تنفسی، بیشترین آمار را در جامعه به خود اختصاص میدهند و اغلب به دلیل عدم تطابق علائم بالینی با بیماري، تشخیص داده نمیشوند. این بیماري در دوره نوزادي به عنوان یک بیماري مرگ زا شناخته شده است وتکرار آن موجب گرفتاريهاي مهم کلیه ازجمله فشارخون بالا و نارساییهاي کلیه میشود، لذا تشخیص به موقع ودرمان مناسب سبب پیشگیري ازعوارض فوق می گردد.[1] باتوجه به گسترش روزافزون مقاومت آنتیبیوتیکی در بین سویههاي مختلف این گروه از باکتريها و افزایش توانایی بیماري زایی آنها در سراسر دنیا، بررسی علل بروز مقاومتهاي آنتی بیوتیکی جدید، و همینطور بررسی فاکتورهاي بیماري زایی در بین این گروه امري ضروري میباشد.امروزه سویههاي مقاوم در سراسر دنیا شیوع پیدا کرده اند و نسبت به بسیاري از آنتی بیوتیکها مثل پنی سیلین از خانواده بتالاکتاماز، اریترومایسین و وانکومایسین و ...مقاوم شدهاند که این امر مقابله با این سویههاي مقاوم را مشکل نموده است، بر این اساس این طرح با هدف تعیین ارتباط میان مقاومت آنتی بیوتیکی و محل نمونهگیري با سروتیپ هاي مختلف و تعیین پلی مورفیسم این سویه ها، و همچنین الگوي مولکولار و فنوتیپی در سویه هاي استافیلوکوکوس مقاوم به آنتی بیوتیکهاي فوق انجام گردید.
مواد و روش ها :
نوع مطالعه و جمعیت مورد مطالعه :در این مطالعه که بصورت توصیفی مقطعی بر روي نمونههاي جمعآوري شده در طول سال 1393-1392به مدت یک سال صورت گرفت، جمعا 200 نمونه کشت ادرارمثبت از بیماران بستري یا مراجعه کننده به بیمارستان ها و آزمایشگاههاي شهر ایلام جمع آوري گردید.
کشت وآزمایشات تعیین هویت باکتري ها
تمامی 200 نمونه اي که کشت ادرار آنها مثبت شده بود، درشرایط استریل به آزمایشگاه میکروب شناسی دانشگاه ایلام منتقل شده و تست هاي تشخیصی افتراقی بیوشیمیائی و میکروب شناسی قرار گرفتند. درکوکسی هاي گرام مثبت ،تمام نمونههایی که آزمایشهاي کاتالاز، اکسیداز، تخمیر مانیتول، تست کواگولاز و تست DNase آن ها مثبت بود جهت آنتی بیوگرام و بررسی وجود ژن تولید توکسین پنتون – والنتین مورد آزمایشات مولکولی قرار گرفتند.
سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک ها
در این طرح، تعیین حساسیت نسبت به 14 آنتی بیوتیک با روش دیسک دیفیوژن - Diskagar diffusion - و به روش Kirby-bauer انجام گردید. دیسکهاي آنتی بیوتیکی به کار رفته عبارتند از: سفوتاکسیم , - Cf=10µg - اکساسیلین , - Ox=10µg - ،کانامایسین , - KA=30µg - تتراسایکلین , - T=30µg - سیپروفلوکساسین - SIp=5 µg - ، کلرامفنیکل - Cl=30 - µg، نیتروفرانشن - Ni=75µg - ، سولفومتاکسازول - So=10 µg - ، پنی سیلین - Pe = 10 Units - ، جنتامایسین - Ge=10 µg - ، نتیل مایسین - Ne =30 µg - ، توبرومایسین - To = 10 µg - ، ونکومایسین - Va-10 µg - و متی سیلین - MT-30 µg - براساس معیارهاي NCCLS1 استفاده گردید.
تعیین MIC با استفاده از روش : ADM2
در این روش پلیتی از آگار واجد تراکمی از آنتی بیوتیکها که در هر قسمت آن یک باکتري کشت می شود تهیه می گردد. سپس از کشت خالص باکتري استاندارد نیم مک فارلند - - 1/5×108 تهیه و مقدار 5 میکرولیتراز سوسپانسیون باکتري در محیط کشت حاوي آنتی بیوتیک تلقیح، و بعد از 24ساعت نتایج قرائت گردید. به این صورت که از بیشترین غلظت به کمترین غلظت رشد باکتري را بررسی، هر جا که رشد متوقف شده بود را مشخص ،و یک غلظت ماقبل آن بعنوان MIC در نظر گرفته شد .[29]
استخراج : DNA
استخراج DNA با استفاده از کیت یکتا تجهیز آزما - - Lot:BDC20114113 ,Cat:YT9001 بر اساس دستوالعمل شرکت سازنده کیت صورت گرفت.
روش PCR براي بررسی وجود ژن : pvl
براي انجام روش مولکولی PCR و وجود ژن pvl پرایمر طراحی گردید، که سکانس نوکلئوتیدي این پرایمر بصورت زیر بود: Luk-PV1-forward: 5′- ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A-3′. 433bp Reverse: 5′- GCA TCA AGT GTA TTG GAT AGC AAA AGC-3′ دراین بررسی از سویه S.aureusATCC25923 بعنوان سویه کنترل منفی و از سویه S.aureus MRSA 400 بعنوان کنترل مثبت استفاده گردید. سویه هاي استاندارد از مرکز پژوهش هاي علمی صنعتی ایران بخش کلکسیون میکروبی تهیه گردیدند.
روش انجام : PCR
براي انجام PCR مخلوط نهایی واکمش با حجم 25 میکرولیتر شامل 0/1 میلی مول از هر آغازگر - - Primer ، 2/5 میکرولیتربافر PCR 1X ، میزان 1/5 میلی مول MgCl2 ، 0/2 میلی مول dNTPs ، 2 میکرولیتر DNA الگو، 1/5 واحد آنزیم - Cinna Gen - Taq DNA polymerase بود که حجم نهایی با آب دیونیزه استریل به 25 میکرولیتر رسانده شد. برنامه دستگاه ترموسایکلر - Master cycler gradient,Ependrof Germany - نیز به اینصورت تنظیم شد که : واسرشتگی اولیه - Initial denaturation - در 95 درجه سانتی گراد براي 5 دقیقه و بعد از آن 35 چرخه شامل
