بخشی از مقاله
چکیده
سویه های انتروپاتوژنیک اشریشیا کلی قادر به ایجاد بیماری در انسان و دام ها می باشد. هدف از این مطالعه شناسایی ژن های مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک های تتراسایکلین و سولفونامید در جدایه های انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی از مدفوع گاومیش های سالم اطراف اهواز است. تعداد 114 نمونه مدفوع از گاومیش های سالم اخذ و جداسازی و تایید بیوشیمیایی اشریشیاکلی اقدام شد. از جدایه ها DNA استخراج و جهت شناسایی ژن های کد کننده پاتوتیپ انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی - - eae, bfp, stx مورد آزمایش قرار گرفت.
هر یک از جدایه های واجد هر یک از ژن های مذکور از نظر وجود ژن های sul1،sul2، tet A واجد یکی از ژن های eae, bfp, stx یا ترکیبی از آن ها بوده اند که به عنوان پاتوتیپ انتروپاتوژنیک در نظر گرفته شدند که از مجموع 104 جدایه.
15جدایه واجد ژن کد کننده اینتیمین تعداد 29 جدایه 29/1 - درصد - تولیدکننده شیگا توکسین شناسایی شد که 11 جدایه - 39/2درصد - حاوی هر دو ژن stx1 و stx2، 15 جدایه 53/57 - درصد - حاوی ژن stx1 و 2 جدایه حامل ژن stx2 بودند و هیچ یک از جدایه ها واجد ژن bfp نبودند. دربررسی ژنتیکی مقاومت آنتی بیوتیکی از 29 جدایه پاتوتیپ انتروپاتوژنیک، 9جدایه - 32/1 درصد - نسبت به ژن sul2 و 5 جدایه 17/8 - درصد - نسبت به ژن tet B مثبت بودند و هیچ کدام از جدایه ها نسبت به ژن های tet A و sul1 مثبت نبودند.
-1 مقدمه
اشریشیاکلی، گونه ای متعلق به جنس اشریشیا و خانوادهی انتروباکتریاسه1می باشد و اندکی پس از تولد چه در انسان و چه در حیوانات خون گرم از محیط اخذ شده و به عنوان یکی از اعضای مهم فلور طبیعی2یا میکروبیوتای 3بخش های پایینی روده در طول زندگی حضور دارد .
پتانسیل بیماری زایی سویه ها، توسط ژن های حدت موجود در باکتری تعیین می شود. عوامل مختلفی در بیماری زایی سویه های EPEC دخیل می باشند. اتصال این سویه ها به انتروسیت ها توسط مولکولی به نام اینتیمین تقویت می شود. برخی سویه های EPEC علاوه بر آن، یک نوع آدزین به نام Bfp دارند که باعث اتصال باکتری به سلول های هدف - عمدتا سلول های اپی تلیال بخش های پایین رودهی باریک و قسمت های بالایی رودهی بزرگ - می شود. به علاوه پروتئینی به نام Esp در ایجاد ضایعات محو کننده در سطح خمل ها نقش دارد
سویه هایی از انتروپاتوژنیک وجود دارد که توانایی تولید ژن شیگا توکسین را دارند که اصطلاحا پاتوتیپ EHEC نامیده می شوند که شامل سویه هایی است که دارای ژن - های - stx1 و/یا stx2 - کدکنندهی شیگا توکسین - می باشند. پاتوتیپ EHEC گروهی از STEC ها می باشند که علاوه بر ژن - های - stx1 و/یا stx2 حاوی ژن eae - کد کنندهی اینتیمین - نیز بوده و مانند پاتوتیپ EPEC، باعث بروز ضایعات اتصالی و محوکننده نیز می شوند.
برای درمان گوساله های بیمار از آنتی بیوتیک های مختلف به شکل سیستمیک یا خوراکی استفاده می شود. آگاهی از الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی، نقش مهمی را در انتخاب بهترین آنتی بیوتیک برای درمان ایفا می کند.
گسترش روز افزون مقاومت های آنتی بیوتیکی باعث بروز مشکلاتی در جهت درمان شده است. بررسی های ژنوتیپی نشان می دهد برخی از سویه های اشریشیاکلی در برابر یکسری از آنتی بیوتیک ها مقاوم هستند و از آن جایی که به طرق مختلف مانند پلاسمیدها، ترانسپوزون ها و اینتگرون ها قادر به انتقال عوامل ژنتیکی مقاومت به سویه های دیگر هستند، شاهد افزایش قابل ملاحظه ی این مقاومت ها هستیم.[
این مقاومت های آنتی بیوتیکی در حیوانات، از طریق گوشت یا دیگر محصولات وارد زنجیر غذایی انسان می شود به همین دلیل است که مقاومت های آنتی بیوتیکی یک تهدید برای سلامت انسان و حیوان به شمار می آید و باید جدی گرفته شود . مطالعات نشان داده است که بروز این مقاومت ها به دلیل حضور ژن های حدت گوناگون می باشد.
بنابراین بررسی ژنوتیپی مقاومت های آنتی بیوتیکی از جوانب مختلف اپیدمیولوژیک، درمانی و پیشگیری دارای اهمیت بسزایی است. در این مطالعه مقاومت آنتی بیوتیکی نسبت به آنتی بیوتیک های دسته تتراسایکلین و سولفونامید ها بررسی شد. مقاومت باکتری¬ها به سولفونامید ¬ها معمولا توسط ژن ¬های sul1، sul2 و sul3 ایجاد می-شود. که در باکتری ¬های گرم منفی مانند سالمونلا و اشریشیاکلی هم در انسان و هم در حیوانات وجود دارد.
مقاومت به تتراسایکلین در بیشتر باکتریها از طریق بدست آوردن ژن مقاومت در آنها ایجاد گردیده است. در حال حاضر 38 نوع ژن مختلف مقاومت tet توصیف شده اند. شماری از ژنهای مقاومت میتوان به tet - A - ، tet - B - ، tet - C - ، tet - D - ، tet - E - ، tet - G - ، tet - H - و tet - L - ژنهای جاری و یا tet - M - ، tet - O - ، tet - S - و tet - W - ژنهای محافظت شده ریبوزومی اشاره کرد
در کشور ما مطالعات زیادی پیرامون جداسازی این سویه از مدفوع گاو انجام شده است اما مطالعات زیادی مبنی بر اینکه گاومیش می تواند یه عنوان یکی از مخازن EPEC مطرح باشد صورت نگرفته است. گاومیش از نظر تولید گوشت و مواد لبنی دارای اهمیت بهداشتی و اقتصادی می باشد، به همین دلیل هدف از این مطالعه شناسایی مولکولی مقاومت آنتی بیوتیکی در سویه های انتروپاتوژنیک اشریشیاکلی جدا شده از گاومیش های سالم اطراف اهواز است.
-2 مواد و روش ها
-2-1 جمع آوری نمونه
تعداد 104نمونه مدفوع از گاومیش های سالم به مدت 6 ماه از مهر تا ا سفند1394 از گاومیش های موجود در ک شتارگاه شهر ستان اهواز جمع آوری شد. نمونه ها در محیط انتقالی - Merck,Germany - Amies قرار داده شد. نمونه ها بلافا صله در کنار یخ به آزمای شگاه میکروبیولوژی دان شکده ی دامپز شکی انتقال داده شد سپس نمونه ها به طور م ستقیم در محیط مک کانکی ک شت داده شدند. پس از رشد باکتری از هر نمونه مدفوعی، کلونی های لاکتوز مثبت برداشت و پس از تایید بر اساس آزمایشات بیوشیمیایی - تست اوره، سیمون سیترات، EMB، TSI و - SIM نسبت به ذخیره سازی آنها اقدام شد.
-2-2 شناسایی سویه های EPEC
برای شناسایی سویه های STEC/EHEC و EPEC از توالی پرایمرهای معرفی شده در مطالعهی چاینا و همکاران در سال 1996 به صورت مولتی پلکیس 4PCRاستفاده شد . - 38 - توالی پرایمرها در جدول 1 آورده شده است. حجم واکنش 25 l PCR بود و غلظت اجزای آن شامل 2/5 l بافر 10x، 2mM منیزیم کلراید، dNTPs 0/2mM، 0/3 M پرایمر، DNA 1U پلیمراز، 5 l DNA و آب مقطر تا حجم واکنش بود. از DNA استخراج شدهی سویهی استاندارد ساکای - باکتری اشریشیاکلی - به عنوان کنترل مثبت و سویهی استاندارد اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در واکنش PCR استفاده گردید.
برنامهی دمایی عبارت بود از: 95C° برای 3 دقیقه، 38 سیکل شامل 95C° برای 1 دقیقه، 53C° برای 1 دقیقه و 72C° برای 1 دقیقه، پس از اتمام سیکل ها 72C° برای 10 دقیقه. در نهایت محصولات PCR الکتروفورز گردیدند و در صورت لزوم در دمای -20C° نگهداری شدند.
برای ژن bfp از DNA استخراج شدهی سویهی استاندارد - ATCC 2348/9 - به عنوان کنترل مثبت و سویهی استاندارد اشریشیاکلی MG1655 به عنوان کنترل منفی در PCR استفاده گردید.
