بخشی از مقاله
چکیده:
آنزیمها مولکولهاي پروتئینی هستند که واکنشهاي شیمیایی را کاتالیز نموده و نقش مهمی در کاهش انرژي مورد نیاز براي واکنش دارند. محیطهاي آبی بدلیل دارا بودن گونه هاي متنوع آبزي اعم از ماهیان و بی مهره گان آبزي ظرفیت بالایی براي کشف و تولید آنزیم هاي مختلف دارند. امعاء و احشاء یکی از مهمترین ضایعات صنایع شیلاتی بوده کهمنبع مهمی از آنزیمهاي گوارشی مخصوصاً پروتئازهاي آسپارتیک اسید همچون آنزیم پپسین هستند. در این مطالعه عصاره آنزیمی معده ماهی شیر را تهیه کرده و فعالیت پروتئنی آن را سنجیده، که این مرحله از اساسی ترین مرحله خالص سازي آنزیم پپسین می باشد.
واژگان کلیدي: آنزیم پپسین، ماهی شیر معمولی، عصاره خام آنزیمی
مقدمه
کلی آنزیمها مولکولهاي پروتئینی هستند که واکنشهاي شیمیایی را کاتالیز نموده و نقش مهمی در کاهش انرژي مورد نیاز براي واکنش دارند؛ اکثر آنزیمهاي موجود در ماهیان و بیمهرهگان آبزي در موجودات خشکزي نیز دیده میشوند ولی داراي تفاوتهایی مثل وزن مولکولی، pH و دماي بهینه، پایداري pH و دمایی، خواص بازدارندگی و عدم نیاز این آنزیمها بهانجام آزمایشات سمشناسی جهت ثابت نمودن ایمنی آنها اشاره کرد Shahidi - و Kamil ،. - 2001 آنزیمهاي موجود در برخی جانوران آبزي فعالیت بالایی در دماي پائین دارند که این امر داراي مزایایی مثل صرفهجویی در هزینه انرژي و جلوگیري از تخریب مواد مغذي حین فرآوري غذا در دماي بالا را بههمراه دارد. امروزه تقاضا براي استفاده از آنزیمهاي پروتئولیتیک ماهی براي فرآوري غذا افزایش یافته است. امعاء و احشاء یکی از مهمترین ضایعات صنایع شیلاتی بوده و 5% از کل بدن ماهی را تشکیل میدهد و منبع مهمی از آنزیمهاي گوارشی هستند Klomklao - و همکاران، . - 2007
از سویی دیگر دفع رایج ضایعات حاصل از فرآوري ماهی سبب ایجاد مشکلات زیست محیطی شده است که به نوبه خود نگرانیهاي عمومی را به دنبال داشته است؛ در بین آنزیمها، پروتئازها مهمترین گروه آنزیمهاي صنعتی را تشکیل میدهند و حدود 60 درصد بازار جهانی آنزیم را به خود اختصاص دادهاند و عمدتاً از حیوانات، گیاهان و میکروبها تهیه میشوند و کاربردهاي زیادي در صنایع غذایی، شویندهها، صنایع چرم، ابریشم و داروسازي دارند Esposito - و همکاران، . - 2009 از جمله این آنزیمها پسین از گروه پروتئازهاي آسپارتیک با ویژگیهاي منحصر به فرد است که چندین کاربرد صنعتی از جمله استخراج کلاژن، تولید پنیر، تولید سیلاژ ماهی، فرآوري ماهی و همچنین استفاده در پژوهشهاي پزشکی را دارا است Ghaly - ، . - 2011
استخراج پپسین از پستانداران مختلفی شامل: انسان Sogawa - و همکاران، - 1983، میمون ژاپنی Takashi Kageyama - و Takahashi، - 1976، خوك Nielsen - و Foltmann، - 1995، گاو MARTIN - و همکاران، - 1982، بز Suzuki - و همکاران، - 1999، موش Norio - و Satoru، - 1979 و خرگوش Kageyama - و همکاران، - 1990 مورد بررسی قرار گرفته است. پپسین همچنین میتواند از ضایعات ماهی بهویژه امعا و احشا ماهی استخراج شود؛ اما استخراج و خالص سازي آن از ماهی و ضایعات آن کمتر انجام شده است Gildberg - و همکاران، . - 1992پپسین با وزن مولکولی 36 کیلو دالتون، پروتئینها را هضم میکند؛ باند پپتیدي توسط تجزیه پروتئینها تحت شرایط اسیدي میتواند به سهولت شکسته شود Suguna - و همکاران، . - 1987
پپسین عمدتا در عصاره لومن معده1 یافت میشود؛ اما می-توان آن را به صورت محدود در خون، عضله و ادرار یافت کرد Boyer - ، 1971؛Armstrong، . - 1919 پپسین ماهی عمدتا در معده وجود دارد ولی میتواند در تخمدان قزل آلا یا پوست ماهی پوفر2 یافت شود Bobe - و Goetz، 2001؛ Kurokawa و همکاران، . - 2005 چند نوع پپسین در معده وجود دارد که هریک ساختار پروتئینی و خواص آنزیمی متفاوتی دارد Shahidi - و Kamil، . - 2001پپسین در غشا معده به شکل غیرفعال به نام پپسینوژن با وزن مولکولی 40 کیلو دالتون، سنتز و ترشح میشود؛ در مقایسه با پپسین، پپسینوژن داراي 44 اسید آمینه اضافی و در محیط قلیایی ضعیف و خنثی پایدار است، ولی وقتی در معرض هیدروکلریک اسید - HCl - موجود در عصاره معده با 1/5 pH تا 2 قرار گیرد، 44 اسید آمینه آن حذف میشوند و در نتیجه به پپسین فعال تبدیل میشود؛ نقش اصلی آن پروتئولیز پروتئین براي حذف اسید آمینههاي آروماتیک - بهعنوان مثال : فنیل آلانین و تیروزین - از بخش N نهایی پروتئین است Johnson - ، . - 2004
مواد و روش ها
تهیه، نمونه برداري از ماهیان و جداسازي معده ماهی
آنزیم پپسین یک آسپارتیک پروتئاز از گروه آنزیم هاي پروتئاز میباشد که محل اصلی آن در معده به شکل غیر فعال، پپسینوژن وجود دارد. بنابراین این آنزیم در ماهیان گوشتخوار بیشتر ترشح میشود. در این صورت براي نمونه برداري و تهیه ماهیان گوشتخوار دریایی تازه از ماهیان صید شده در دریاي خلیج فارس استفاده شد و براي این منظور ماهیان تازه صید شده اي که به بازار ماهی فروشی بندر عباس انتقال داده میشدند را انتخاب و تهیه کرده و پس از شسستشو و پاك کردن ماهی از گل و لاي هاي آب دریا و بقیه آلودگی ها سپس طول و وزن متوسط ماهیان اندازه گیري شده و با جداسازي امعا و احشا ماهی و جدا کردن معده ماهی در کنار یخ، معده ماهی را شستشو داده و با خالی کردن محتویات درونی معده، آن را در کیسه هاي زیپ کیپ بسته بندي کرده و داخل یونولیت حاوي یخ قرار داده شده و هر روز این عملیات از ساعت 7 صبح تا 3 بعد از انجام میشد. کنار ماهی فروشاي بندر عباس یک سردخانه اي جهت بسته بندي و فریز ماهی و دیگر محصولات غذایی با سرد خانه هایی با -20 درجه سانتیگراد وجود داشت که پس از جمع آوري چند معده و پر شدن کیسه زیپ کیپ و پس از نگهداري موقت در یونولیت حاوي یخ به سردخانه انتقال داده میشد.
علاوه بر اینکه در زمان نمونه برداري در نیمه دوم آبان ماه، هواي شهر بندر عباس دما هاي پاپپن را در بر می گرفت.زمان نمونه برداري 15 روز طول کشید به این دلیل که ماهیان بزرگتر حاوي معده بزرگتري هستند و از 8 گونه نمونه برداري شد و این مدت را در انتظار ماهیان تازه و بزرگ میشدیم که پس از جمع آوري، بسته بندي و فریز تعداي زیادي از معده هاي ماهی هاي مختلف جمع آوري و در نهایت این بسته بندي هاي فریز شده را بدون یخ درون یونولیت قرار داده و اطراف یونولیت را به منظور جلوگیري از نفوذ هوا با چسب 5 سانتی بسته بندي کرده و سپس دو یونولیت آماده شده را با اتوبوس مسافربري با مدت زمان 20 ساعت به اهواز و سپس به فریزر -80 درجه سانتیگراد آزمایشگاه موسسه واکسن و سرم سازي- اهواز انتقال داده شد. ساعت حرکت اتوبوس در 10 صبح و زمان رسیدن آن به اهواز تا 4 صبح فرداي آن روز به طول انجامید با توجه به سردي هوا اواخر آبان ماه مسیر بندر عباس- اهواز پس از رسیدن به اهواز نمونه ها به همان حالت اولیه انجماد باقی ماندن و تا شروع آزمایش ها در فریزر-80 نگهداري شدند.
تهیه عصاره خام آنزیمی - پپسینوژن - از معده ماهی شیرمعمولی
معده هاي ماهی شیر از فریز -80 درجه سانتیگراد خارج شده و در یخچال معمولی قرار داده شد که انجماد زدایی صورت بگیرد و پس از انجماد زدایی، معده ماهی را با آب جاري و سرد شسته و آن را تشریح کرده و سپس محتویات درونی آن خارج شده و در کنار یخ، معده ماهی را به قطعات کوچکتر و سپس چرخ کرده و پس از ریز شدن توسط هموژنایزر با نسبت 1:3 با استون سرد مخلوط شده و سپس هموژن شده و پس از آن محلول هموژن شده با کاغذ فیلتر وات من نمره یک طی یک شب در دماي اتاق صاف شده و روز بعد با نسبت1:10 با 20میلی مولار بافر تریس- HCL با pH برابر با 7,5 به مدت 3 ساعت در حضور یخ به آرامی مخلوط شده و سپس با دور 15000 gبه مدت 20 دقیقه در دماي 4 درجه سانتیگراد سانترفیوژ شد.محلول رویی حاصل از سانترفیوژ بعنوان عصاره خام آنزیمی جمع آوري شده و در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداري شد و رسوب حاصل از سانترفیوژ دور ریخته شد.
