بخشی از مقاله
بررسي خصوصيات مرفولوژيکي و بيماري زايي جدايه هاي قارچ Colletotrichum gloeosporioides عامل آنتراکنوز مرکبات
چکيده
به منظور مطالعه تنوع در ويژگيهاي قارچ .Sacc&Penz.(Colletotrichum gloeosporioides)Penz. عامل آنتراکنوز مرکبات ، طي سال هاي ٨٣-١٣٨١ از درختان آلوده در سطح استان گلستان نمونه برداري شد و جدايه هاي آن روي محيط کشت سيب زميني، دکستروز، آگار(پ د آ) تک اسپور و خالص شدند. سپس جدايه هاي اين قارچ مورد بررسي قرار گرفتند. در بررسيهاي انجام شده ، جدايه ها از نظر مرفولوژيکي و بيماريزايي در دو گروه قرار ميگرفتند. گروه اول ، جدايه هاي سريع الرشد بوده که پرگنه هاي خاکستري رنگ و ميسليوم فراوان داشته و کنيديوم هاي استوانه اي بلند با دو انتهاي گرد توليد کردند. گروه دوم ، داراي سرعت رشد کند و پرگنه هاي نارنجي رنگ حاوي توده هاي کنيديومي فراوان بودند.
کنيديوم هاي اين گروه دوکي شکل و کوتاه تر از گروه اول و واجد يک انتهاي گرد و انتهاي ديگر دوکي شکل بود. سرعت رشد روي محيط کشت غذايي س د آ در جدايه هاي گروه اول دو برابر سرعت رشد جدايه هاي گروه ديگر بود. همچنين همه جدايه ها در شرايط نوري ممتد روي محيط غذايي پ د آ کشت داده شدند و پس از ١٠ روز وجود يا عدم خار در آنها بررسي شد. بيشتر جدايه هاي گروه اول خارهايي با ٤ ديواره عرضي توليد نمودند. جدايه هاي گروه دوم خار توليد نکردند. به منظور بررسي و اثبات بيماريزايي، جدايه هاي قارچ C. gloeosporioides به برگ ها و شکوفه هاي درختان پرتقال (Citrus sinensis) مايه زني شدند. جدايه ها از نظر بيماري زايي روي شکوفه هاي جدا شده از درختان قابل تشخيص از يکديگر نبودند. همچنين از مايه زني جدايه هاي گروه اول به شکوفه هاي روي درختان ، هيچ گونه علائم خاصي که نشانه نقش آنها در پديده ريزش ميوه ها پس از گلدهي باشد، مشاهده نشد؛ در حالي که جدايه هاي گروه دوم از گلبرگ هاي بيمار جدا شدند. جدايه هاي گروه اول از برگ ها جدا شدند. از مايه زني جدايه هاي گروه دوم به برگ ها علائم خاصي مشاهده نشد.
واژه هاي کليدي: جدايه هاي عامل آنتراکنوز، خصوصيات مرفولوژيکي و بيماريزايي، مرکبات ، استان گلستان
مقدمه
قارچ عامل آنتراکنوز Colletotrichum .Sacc&Penz. (Penz.)gloeosporioides يکي از شايع ترين قارچ هايي است که از روي بسياري از نهاندانگان شامل ١٩٧ گونه از گياهان زراعي، باغي، سبزيجات ، علف هاي هرز و انواع مرکبات گزارش شده است (ارشاد، ١٣٧٤؛ داوريان و همکاران ، ١٣٨٢؛ آگوستيني و همکاران ، ١٩٩٢؛ فار و همکاران ، ١٩٨٩؛ اوهم و همکاران ، ٢٠٠٣).
مورديو (١٩٧١) اين قارچ را عامل آنتراکنوز ساقه و برگ ، خشکيدگي سرشاخه ها، پوسيدگي ريشه ، لکه برگي، پوسيدگي ميوه و مرگ گياهچه در گياهان مختلف معرفي کرده است . همچنين به عنوان عامل بيماري آنتراکنوز بادام (فورشر و آداسکاوي، ١٩٩٩)، ريزش ميوه ها درانار (جامادار و همکاران ، ٢٠٠٠)، زخمي شدن ميوه هاي سيب (کاروالهو و همکاران ، ٢٠٠٠؛ ويو و همکاران ، ٢٠٠١)، آنتراکنوز سيب زميني شيرين ، باقلاي مصري و نعناع (ابنگ و همکاران ، ٢٠٠٢؛ کيم و همکاران ، ٢٠٠١؛ ليندر و همکاران ، ٢٠٠١؛ سينگ و ناکوي، ٢٠٠١؛ توماس و سوئيتينگ هام ، ٢٠٠٠) گزارش شده است . در مرکبات نيز از جمله شايع ترين قارچ ها محسوب شده که هر ساله خسارت آن موجب کاهش محصول ميشود. اين بيمارگر علاوه بر نکروز برگ ها و سرخشکيدگيها به طور مؤثري سبب کاهش سطح فتوسنتز در برخي از گياهان مذکور ميشود (ابنگ و همکاران ، ٢٠٠٢).
قارچ عامل آنتراکنوز در مرکبات بيشتر روي بافت هاي پير و مرده مشاهده ميشود که آسروول هاي کم و بيش بشقاب مانند فراواني توليد ميکند. همچنين کنيديوم هاي آن روي سطح برگ ها و ميوه ها جوانه زده ، توليد اپرسوريوم ميکنند (جعفرپور و فلاحتي رستگار، ١٣٧٦؛ اسميت و بلک ، ١٩٩٠). وقتي اين بافت ها بر اثر عوامل مختلف ضعيف شده يا از بين بروند سطح آنها سريعا توسط قارچ مذکور پوشيده ميشود، هر چند که ممکن است قارچ C. gloeosprioides در چنين شرايطي به عنوان يک عامل بيماريزا در مرکبات تلقي نشود (وايت سايد، ١٩٨٨). تحقيقات اخير نشان داده است که فقط جدايه هاي خاصي از C. gloeosporioides از مرکبات ، عامل واقعي ريزش ميوه ها پس از گلدهي١ يا آنتراکنوز ساقه و برگ ميباشند (آگوستيني و همکاران ، ١٩٩٢؛ ليانيج و همکاران ، ١٩٩٢؛ سونودا و پلوسي، .(1988
گروه بندي جدايه هاي C. gloeosporioides بر اساس خصوصيات مرفولوژيکي و فيزيولوژيکي، اولين بار در سال ١٩٢١ توسط برگر (١٩٢١) انجام شد. پس از آن نيز اين گونه به عنوان يک قارچ تغييرپذير با تعداد بسيار زيادي جوره ٢ مرفولوژيکي شرح داده شده است (آفانادور کافوري و همکاران ، ٢٠٠٣؛ ون آرکس ، ١٩٥٧). هدف از اين مطالعه ، توصيف و مشخص کردن فرم هاي مختلف قارچ C. gloeosporioides به دست آمده از مرکبات و نقش آنها در بيماري آنتراکنوز و ريزش ميوه ها پس از گلدهي ميباشد.
مواد و روش ها
جدايه ها: به منظور تهيه جدايه ها، از درختان مرکبات داراي علائم ، نمونه هايي شامل سرشاخه هاي خشکيده ، برگ ها و ميوه هاي لکه دار و شکوفه هاي نکروزه تهيه شد.
جهت جداسازي اين جدايه ها از محيط کشت غذايي سيب زميني دکستروز آگار (پ - د- آ) و محيط کاغذ صافي مرطوب در دماي بهينه ٢٧-٢٣ درجه سانتيگراد استفاده شد و نمونه ها پس از گندزدايي با هيپوکلريت سديم ٠.٥ درصد کشت داده و جدايه هاي به دست آمده به روش تک اسپوري٣ خالص گرديدند (رهنما و ممرآبادي، ١٣٨٢).
بررسي خصوصيات کنيديوم ها: از کشت هاي ١٠-٧ روزه جدايه ها روي محيط کشت غذايي پ - د- آ در دماي ٢٧ درجه سانتيگراد به منظور بررسي خصوصيات کنيديوم ها استفاده شد. از هر جدايه به تفکيک اسلايد موقت تهيه شده و ١٠٠ کنيديوم از لحاظ شکل و اندازه طولي و عرضي مورد بررسي ميکروسکوپي قرار گرفتند.
توليد خار: جهت بررسي توليد خار٤، همه جدايه ها در شرايط نوري مداوم روي محيط کشت غذايي پ - د- آ رشد داده شدند و پس از ١٠ روز وجود يا عدم خار در آنها بررسي شد. همچنين جدايه ها به برگ ها و شاخه هاي اتوکلاو شده پرتقال .Osbeck (L.)Citrus sinensis در ظروف پتري مايه زني شدند و پس از ١٥ روز در خصوص توليد خار مورد بررسي قرار گرفتند.
اثرات دما: بدين منظور قطعات ٤ ميليمتري از همه جدايه هاي کشت داده شده ، به روي محيط کشت جديد پ - د- آ منتقل شده و در دماهاي ١٠، ١٥، ٢٣، ٢٧، ٣١ و ٣٥ درجه سانتيگراد در انکوباتور قرار داده شدند. چهار تکرار براي هر جدايه مورد استفاده قرار گرفت . قطر پرگنه روزانه و به مدت ٧ روز اندازه گيري شد و پس از ٧ روز ميانگين رشد محاسبه گرديد.
اثبات بيماريزايي: بدين منظور جدايه هاي کشت داده شده روي محيط کشت پ - د- آ، پس از ٥ روز، ازسطح ظروف پتري شسته شده و پس از عبور از کاغذ صافي، سوسپانسيون اسپور تهيه گرديد و به غلظت مورد نظر رسانيده شد.
الف ) بررسي اثر جدايه هاي قارچ روي شکوفه هاي جدا شده از درختان : تعدادي شکوفه باز نشده از درختان پرتقال (C. sinensis) عاري از بيماري جمع آوري شده و در ظروف پتري حاوي کاغذ صافي مرطوب قرار داده شدند. به منظور جلوگيري از آلودگي سطحي، قبل از مايه زني، شکوفه ها ابتدا به مدت ٣٠ ثانيه توسط هيپوکلريت سديم ٠.٥ درصد و سپس توسط آب مقطر استريل ضدعفوني شدند. در نهايت ٢ قطره از سوسپانسيون اسپور حاوي ١٠٥×٢ کنيديوم در هر ميليليتر روي هر شکوفه ريخته شد و ظروف به مدت ٣ روز در دماي اتاق نگهداري شدند
. براي هر جدايه ، ٤ تکرار و هر کدام حاوي ٣ شکوفه در ظروف پتري استفاده گرديد. روي شکوفه هاي شاهد فقط آب مقطر استريل ريخته شد.
ب ) مطالعه بيماريزايي جدايه ها روي درختان حاوي شکوفه : جهت مايه زني روي درختان پرتقال ، از هر جدايه سوسپانسيوني با غلظت ١٠٦ کنيديوم در هر ميليليتر تهيه شده و توسط آب پاش دستي روي شکوفه هاي درختان و برگ هايي که به وسيله سوزن استريل کمي خراش داده شده بودند، پاشيده شدند، به طوري که سوسپانسيون شکوفه ها و برگ ها را کاملا خيس کند. سپس به منظور حفظ رطوبت مناسب به مدت ٤٨ ساعت روي آنها پوشش پلاستيک کشيده شد و سپس در گلخانه با تغييرات دمايي ٣٤-١٩ درجه سانتيگراد نگهداري گرديدند.
نتايج و بحث
به رغم اين که همه جدايه ها از مرکبات جدا شده اند، اما به طور اساسي تفاوت هايي در مرفولوژي، ميزان رشد، خصوصيات پرگنه و بيماريزايي آنها مشاهده شد.
مرفولوژي قارچ : جدايه هاي به دست آمده قارچ C. gloeosporioides از مرکبات با استفاده از نوشته هاي ون آرکس (١٩٥٧)، مورديو (١٩٧١)، بيلي و جگر (١٩٩٢) و ساتن (١٩٩٨) مورد بررسي و تشخيص قرار گرفتند. اين جدايه ها بر اساس خصوصيات
مرفولوژيکي و سرعت رشد به دو گروه تقسيم شدند: گروه اول ، جدايه هايي با پرگنه هاي خاکستري رنگ بوده که سرعت رشد بالايي داشته ، ميسليوم فراوان توليد ميکنند و اختصارا خ - س - ر١ ناميده شدند. دراين تيپ جدايه تفاوت هايي در مقدار رنگدانه هاي خاکستري ميسليوم ها مشاهده شد؛ بدين صورت که رنگ پرگنه ها از خاکستري پررنگ تا کم رنگ و تا حدودي مايل به سفيد تغيير مي کرد(شکل ٢، الف ). گروه دوم ، جدايه هايي بودند با سرعت رشد آهسته و حاوي توده هاي کنيديومي نارنجي رنگ فراوان که به طور اختصاري ن - ک- ر٢ ناميده شدند. در اين گروه نيز تغييراتي در ميزان توليد کنيديوم ها و رنگدانه ها پس از چندين بار خالص سازي مشاهده شد، با اين حال ميزان رشد پرگنه هاي جديد مشابه جدايه هاي اصلي بود (شکل ٢، ب ). جدايه هاي خ - س - ر داراي کنيديوم هاي بزرگتري نسبت به جدايه هاي ن - ک- ر از لحاظ اندازه طولي و عرضي بودند (جدول ١). در شکل هاي کنيديوم ها نيز تفاوت هايي مشاهده شد که بر اين اساس به دو گروه تقسيم شدند: اکثر کنيديوم هاي توليد شده توسط جدايه هاي خ - س - ر داراي دو انتهاي گرد بوده و کمتر از ٢٠ درصد از آنها داراي يک انتها ي دوکي شکل بودند (شکل ٣، الف ). در مورد جدايه هاي FGG گزارش شده توسط آگوستيني و همکاران (١٩٩٢)، اين ميزان ١٠ درصد گزارش شده بود.
همچنين بيشتر کنيديوم هاي توليد شده توسط جدايه هاي ن - ک- ر داراي يک انتهاي گرد بوده ، انتهاي ديگر آنها دوکي ميباشد (شکل ٣، ب ).
اکثر جدايه هاي خ - س - ر هم روي محيط کشت و هم روي بافت ميزبان به مقدار فراوان خار توليد ميکردند (شکل ٤، جدول ١). اکثر خارهاي مشاهده شده داراي ٤ ديواره عرضي بودند. همچنين هيچ گونه توليد کنيديوم از اين خارها مشاهده نشد. جدايه هاي ن - ک- ر نه در بافت ميزبان و نه در محيط کشت پ - د- آ خاري تشکيل ندادند.
لازم به ذکراست که هر دو گروه جدايه با جدايه هاي گزارش شده توسط سونودا و پلوسي (١٩٨٨) از فلوريدا مشابهت دارند. همچنين جدايه هاي خ - س - ر تحقيق حاضر، با فرم cgm گزارش شده توسط فاگان (١٩٨٠)، از لحاظ تشکيل خار با ٤ ديواره عرضي مشابهت دارند.
جدايه هاي FGG گزارش شده توسط آگوستيني و همکاران (١٩٩٢) همگي داراي يک ديواره عرضي بودند.
جدايه هاي کشت شده روي محيط کشت پ - د- آ به غير از يک جدايه از خ - س - ر، همگي تا ٢٢ ماه در دماي ٤ درجه سانتيگراد زنده ماندند. فرم جنسي اين قارچ (.Stonem)Glomerella cingulata .Schrenk &Spauld. است که توليد پريتسيوم ميکند و در اين تحقيق روي محيط کشت پ - د- آ و بافت ميزبان در شرايط طبيعي باغات مشاهده نشد. روحي بخش (١٣٧٦) و ابنگ و همکاران (٢٠٠٢) اين فرم جنسي را گزارش کرده اند. روحي بخش (١٣٧٤) پريتسيوم ها را از جدايه هايي که در فصل پاييز به دست آمده و در محيط غذايي پ - د- آ کشت داده شده بودند، جدا نموده است .
