بخشی از مقاله
چکیده
بیماري میوه سبز مرکبات یکی از بیماري هاي خطرناك مرکبات و جزء بیماري هاي قرنطینه اي کشور محسوب می شود. عامل بیماري در ایران باکتري Candidatus Liberibacter asiaticus می باشد. ردیابی باکتري Candidatus Liberibacter spp از طریق جمع آوري نمونه هاي مشکوك از پنج بخش شمال استان کرمان صورت گرفت. به منظور ردیابی، از واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - با استفاده از آغازگرهاي تخصصی OI1/OI2c و A2/J5 استفاده شد. در محصول PCR با هر دو جفت آغازگر، باندهاي مورد انتظار در نمونه هاي آلوده مشاهده گردید.
وجود باند 703 جفت بازي حاصل از PCR با آغازگرهاي A2/J5 و همچنین نتایج هضم آنزیمی محصول PCR با آغازگرهاي OI1/OI2c توسط آنزیم XbaI وجود گونه Candidatus Liberibacter asiaticus را تایید کرد. نتایج حاصل از تعیین توالی محصول PCR با جفت آغازگر A2/J5 ، یک توالی 703 نوکلئوتیدي را مشخص نمود. نتایج همردیفی با توالی هاي ژن پروتئین rplJ - L10 - ریبوزومی Candidatus Liberibacter asiaticus موجود در بانک اطلاعاتی NCBI نشان داد که ایزوله ارزوئیه بیشترین شباهت را به ترتیب با ایزوله سیستان - ایران - و ایزوله هاي ET-LAS01 و ET-LAS02 - اتیوپی - دارد.
مقدمه
بیماري میوه سبز مرکبات - هوانگ لانگ بینگ - 1 یکی از بیماري هاي مهم مرکبات در آسیا، آفریقاو اخیرًدر آمریکا - برزیل و فلوریدا - محسوب می شود . - 2 - این بیماري در ایران از جمله بیماري هاي قرنطینه اي مرکبات به شمار می رود و به تازگی از برخی نقاط استان هاي سیستان و بلوچستان و هرمزگان گزارش شده است . - 1 - عامل بیماري باکتري گرم منفی محدود به آوند آبکش با نام Candidatus Liberibacter می باشد . - 7 - این باکتري داراي سه استرین شناخته شده، آسیایی Candidatus Liberibacter asiaticus ، آفریقایی Candidatus Liberibacter africanus و آمریکاییCandidatus Liberibacter americanus است - 6و. - 9 عامل بیماري در ایران استرین Candidatus Liberibacter asiaticus شناخته شده که از طریق پسیل آسیایی مرکبات Diaphorina citri منتقل می شود .
- 1 - مهمترین علائم بیماري میوه سبز مرکبات شامل وجود برگ هایی سبز روشن تا زرد همراه با ابلقی یا ماتلینگ1 می باشد که به دلیل مشابهت با علائم کمبود مواد غذایی و سایر بیماري ها تشخیص بیماري را بر اساس علائم ظاهري مشکل می کند . - 8 - همچنین غلظت پایین عامل بیماري ردیابی آن را از طریق روش هایی مثل میکروسکوپ الکترونی و الایزا محدود ساخته است . - 4 - ردیابی دقیق تر عامل بیماري با استفاده از واکنش هاي زنجیره اي پلیمراز - PCR - به منظور تکثیر قسمتی از ژن 16s rDNA با استفاده از آغازگرهاي تخصصی - OA1+OI1 - /OI2c در سال 1996 انجام شد. در روشی دیگر با تکثیر قسمتی از توالی ژن پروتئین ریبوزومی rplJ - L10 - با استفاده از جفت آغازگر تخصصی A2/J5 دو استرین آسیایی و آفریقایی را به راحتی می توان بر اساس اختلاف در اندازه قطعه تکثیر شده از هم متمایز کرد 3 - و. - 5 هدف از این مطالعه ردیابی و تعیین ویژگی هاي مولکولی عامل بیماري میوه سبز مرکبات در شمال استان کرمان می باشد.
مواد و روش ها:
مواد گیاهی در مهر ماه 1389، 600 نمونه مرکبات داراي علائم ظاهري مشکوك به این بیماري از مناطق مرکبات خیز شمال استان کرمان شامل: بم، ریگان، فهرج، شهداد و ارزوئیه جمع آوري شده و بر روي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. استخراج DNA و واکنش PCR از نمونه هاي ارسالی به آزمایشگاه حدود 0/1 گرم بافت رگبرگ جداسازي و استخراج DNA با استفاده از کیت DNA Genomic Purification Kit شرکت Fermentas ، بر اساس دستورالعمل کیت انجام شد.
هضم آنزیمی
محصول PCR با جفت آغازگر OI1/OI2c به منظور تعیین استرین پاتوژن با آنزیم XbaI هضم شد. هضم آنزیمی در حجم 20 میکرولیتر و به مدت 1 ساعت انکوباسیون در 37◦C و سپس 10 دقیقه در 65 ◦C - به منظور غیر فعال سازي - انجام گرفت. محصول PCR با هر دو جفت آغازگر و نتایج هضم در روي ژل آگارز یک درصد با استفاده از بافر TBE یک درصد الکتروفورز شدند. تعیین توالی و آنالیز ژن تکثیر شده محصول PCR حاصل از جفت آغازگر A2/J5 به منظور تعیین توالی به شرکت Millegen فرانسه ارسال شد. نتایج حاصل از تعیین توالی بااستفاده از نرم افزار BioEdit ver 7.0.4.1 آنالیز و با سایر توالی هاي مشابه موجود در بانک ژن NCBI مورد مقایسه قرار گرفت.
نتایج و بحث
قطعات مورد انتظار در واکنش PCR با هر دو جفت آغازگر، تنها در سه نمونه از نمونه هاي جمع آوري شده از منطقه ارزوئیه - قادرآباد و دولت آباد - مشاهده شد. قطعه 703 جفت بازي حاصل از PCR با آغازگرهاي A2/J5 و قطعه 1160 جفت بازي حاصل از PCR با جفت آغازگر OI1/OI2c آلودگی به عامل میوه سبز مرکبات را مشخص نمود - تصویر شماره . - 1 وجود باند 703 جفت بازي حاصل از PCR با آغازگرهاي A2 و J5 و همچنین نتایج هضم آنزیمی محصول PCR با آغازگرهاي OI1 و OI2C توسط آنزیم XbaI و مشاهده دو باند تقریبی 520 و 640 جفت بازي، وجود گونه Candidatus Liberibacter asiaticus را تایید کرد - تصویر شماره. - 2
بر اساس نتایج بدست آمده از رشته هاي رفت و برگشت توالی یابی و با استفاده از نرم افزار BioEdit توالی 703 نوکلئوتیدي قطعه حاصل از PCR بدست آمد. توالی مورد نظر در بانک ژن NCBI با نام ایزوله ارزوئیه و کد JF261098 ثبت شد. مقایسه قطعه توالی یابی شده با توالی هاي ژن پروتئین L10 ریبوزومی موجود در بانک اطلاعاتی NCBI به روش بلاست نشان داد که این قطعه - ایزوله ارزوئیه - با تعدادي از توالیهاي موجود در بانک اطلاعاتی داراي همولوژي می باشد. بیشترین همولوژي را با ایزوله سیستان که از منطقه سیستان و بلوچستان ایران گزارش شده، داشت. به منظور بررسی بهتر تشابه و تفاوت بین ایزوله هاي استرین آسیایی همردیفی نوکلئوتیدي بین چندین ایزوله انجام شد.
نتایج نشان داد که دو ایزوله ایرانی گزارش شده کاملا مشابه بوده ولی در 3 باز با سایر ایزوله هاي گزارش شده از استرین آسیایی متفاوت می باشند به استثنا ایزوله گزارش شده از اتیوپی که تنها در دو باز با ایزوله هاي ایران تفاوت نشان داد. بر اساس این نتایج و نتایج حاصل از ماتریس فاصله، ایزوله ارزوئیه بیشترین تشابه را با ایزوله سیستان و سپس با ایزوله هاي ET-LAS01 و ET-LAS02 اتیوپی دارد. توالی ایزوله ارزوئیه داراي منطقه CDS در محدوده بازهاي 207-703 می باشد و از آنجا که بازهاي تغییر یافته در خارج از این محدوده قرار دارند در نتیجه توالی پروتئینی ایزوله هاي ایران با سایر ایزوله هاي استرین آسیایی متفاوت نمی باشد.
