بخشی از مقاله
چکیده
یک محیط کشت مناسب براي تکثیر یک گونه باکتري پروبیوتیک تولید شده و کارائی آن با محیط کشت ام آر اس مقایسه گردید. بدین منظور جو درشرایط مناسب به مالت تبدیل شده و عصاره آن مورد هیدرولیز آنزیمی قرار گرفت. باکتري پروبیوتیک بصورت بی هوازي درفرمانتور 5 لیتري در دماي 37درجه سانتیگراد و pH برابر 5/7 در دو محیط کشت تکثیر شده و حداکثر جرم خشک سلولی حاصل از هر محیط کشت اندازه گیري گردید. نسبت جرم خشک سلولی به وزن خشک اولیه محیط کشت در محیط ام آر اس 0/056 و در محیط عصاره مالت 0/058 بوده و حاکی ازمناسب بودن محیط کشت اخیر است. این محیط کشت ارزانتر از محیط هاي مرسوم بوده و براي تولید لاکتوباسیل ها درمقیاس صنعتی قابل استفاده بنظر میرسد.
کلمات کلیدي: پروبیوتیک، عصاره مالت جو، لاکتوباسیل ، فرمانتور
مقدمه
لاکتوباسیل ها کاربرد وسیعی بعنوان کشت هاي آغازگر و پروبیوتیک داشته و اخیرا بدلیل افزایش سریع مصرف اسیدلاکتیک در تولید بیوپلیمرهاي زیست تخریب پذیر اهمیت روزافزونی یافته اند. یکی از مهمترین گلوگاه هاي اقتصادي درتکثیر این باکتریها درمقیاس صنعتی ملزومات غذائی متنوع آنهاست که استفاده از ترکیبات گرانقیمت از جمله عصاره مخمر را در محیط کشت آنها اجتناب ناپذیر میسازد. پژوهشهاي مختلفی براي استفاده از منابع ارزانقیمت بجاي عصاره مخمر گزارش گردیده که عموما کارائی لازم را نداشته اند. دریک مورد نیز عصاره ریشه هاي جو جایگزین قسمتی از عصاره مخمر گردیده است.[1]
دراین تحقیق یک محیط کشت از مالت جو تهیه شده و کارائی آن در تکثیر یک باکتري لاکتوباسیل بررسی گردید. تحقیقات تکمیلی براي بهینه سازي شرایط تولید محیط کشت ضرورت دارد.
مواد و روشها باکتري بررسی شده یک گونه لاکتوباسیل با خواص پروبیوتیکی براي طیور بود.[2] آزمایش ها در فرمانتور مدل AGCH-4103 ساخت کمپانی Infors سوئیس به ظرفیت 5 لیتر انجام گرفت. تخمیر بی هوازي بوده و دما در 37 درجه سانتیگراد و همزدن در 150 دور در دقیقه و pH درمقدار 5/7 کنترل می گردید. اسید لاکتیک تولیدي با اندازه گیري مقدار سود مصرفی براي کنترل pH محاسبه شده و غلظت قند هاي احیائی نمونه ها به کمک [3]DNS اندازه گیري می شد.
براي اندازه گیري وزن خشک سلولی نمونه سانتریفوژ شده و رسوبات حاصل دو بار شسته و سپس در آون خشک و توزین می شد. تمام مواد شیمیائی مورد استفاده ساخت شرکت مرك بودند.
آزمایش با محیط کشت ام آر اس: ترکیب استاندارد محیط کشت ام آر اس برحسب گرم بر لیتر شامل گلوکز 20، عصاره مخمر 5، پروتئوز پپتون 10، عصاره گوشت 10، سیترات آمونیم 0/2، سولفات منیزیم 0/2، سولفات منگنز 0/05، دي سدیم فسفات 2، و توین 1 است. مقدار یک لیتر خوراك ام آر اس با غلظت استاندارد تهیه شده و پس از استریل کردن در فرمانتور 40 میلی لیتر پیش کشت حاصل از تکثیر سویه مورد بحث در محیط ام آر اس به آن افزوده شده و فرمانتور شروع به کار نمود. از محلول سود یک نرمال براي کنترل pH استفاده شد. پس از اطمینان از توقف رشد مقدار 500 میلی لیتر محیط استریل ام آر اس با غلظت 5 برابر مقدار استاندارد به فرمانتور افزوده شده که در نتیجه رشد مجددا آغاز گردید و انجام تخمیر تا اطمینان از توقف رشد ادامه یافت.
تهیه محیط کشت عصاره مالت: مقداري جو به مدت 10 ساعت در آب در دماي 15/5 درجه سانتیگراد خیس داده شده و سپس آب آن تخلیه شده وبه مدت شش ساعت در همین دما قرار داده می شد دوباره به مدت هشت ساعت خیس خورده و آنگاه در سینی هائی پهن شده و در دماي مذکور در هواي اشباع قرار داده شده و در فواصل زمانی مناسب براي پیشگیري از خشک شدن آب برسطح سینی ها اسپري میگردید. عملیات در یک ژرمیناتور با قابلیت کنترل دما و رطوبت انجام می گرفت. پس از رسیدن طول جوانه به حدود %90 طول دانه ، دانه ها در دماي 55 درجه در آون به مدت بیست و چهار ساعت خشک می شد. سپس دانه ها آسیاب شده و آرد حاصل با سه برابر وزنی آب مخلوط شده و سوسپانسیون حاصل در دماي 50 درجه سانتیگراد در داخل بن ماري قرار داده می شد. پس از گذشت شش ساعت دما به 55 درجه سانتیگراد افزایش داده شده و به مدت 12 ساعت در این دما حفظ می گردید. درپایان مقدار مناسبی آنزیم گلوکوآمیلاز به آن افزوده شده و به مدت دو ساعت دیگر در دماي 60 درجه قرار داده شده و سپس دما به 75 درجه افزایش داده می شد. سوسپانسیون حاصل سانتریفوژ شده و محلول زلال بالائی به عنوان خوراك تخمیر تا زمان مصرف در یخچال نگهداري می شد.
آزمایش با محیط کشت عصاره مالت: با استفاده از عصاره مالت تولیدي خوراکی شامل: جامدات عصاره مالت 120، دي سدیم هیدروژن فسفات 1/5، سدیم دي هیدروژن فسفات 1/5، سیترات آمونیوم 0/6، سولفات منیزیم 0/6، و سولفات منگنز 0/15 گرم بر لیتر تهیه شده و رشد سویه مورد بحث در آن درفرمانتور بررسی گردید. املاح مزبور جداگانه استریل شده و به محیط کشت متشکل از عصاره مالت که در داخل فرمانتور استریل شده بود افزوده شد. حجم اولیه محیط کشت 1/5 لیتر بود که بوسیله 40 میلی لیتر پیش کشت حاوي باکتري مورد بحث تلقیح شد و آزمایش انجام گرفت.pH محیط کشت به کمک محلول سود 5 نرمال کنترل شده و در فواصل زمانی مناسب از فرمانتور نمونه گیري بعمل می آمد.
نتایج و بحث ابتدا مقدار جرم سلولی قابل حصول در محیط ام آر اس در فرمانتور اندازه گیري گردید. نتایج نشان داد که به ازاي 160 گرم ماده خشک ام آر اس مصرفی حدود 9 گرم جرم خشک سلولی تولید شده است. این مقدار با نتایج بدست آمده در ارلن که در آن حداکثر تولید جرم سلولی در محیط ام آر اس با غلظت استاندارد 2/5 گرم بر لیتر بوده توافق دارد. در این آزمایش به ازاي 70 گرم گلوکز مصرفی 37/8 گرم اسید لاکتیک تولید گردید که ناشی از هترولاکتیک بودن سویه مورد بحث است.
روند مصرف قندهاي احیائی ، تولید اسید لاکتیک و تولید جرم سلولی درمحیط عصاره مالت در شکل 1 ارائه شده است همانگونه که دیده میشود بیش از % 90 قند اولیه مصرف شده که حاکی از مناسب بودن نوع قند عصاره مالت براي باکتري است. حدود 45 گرم بر لیتر اسید لاکتیک تولید شده که مقدار آن حدود نصف وزن قند مصرفی بوده و با نتایج آزمایش ام آر اس هماهنگی دارد. جرم سلولی تولید شده حدود 7 گرم برلیتر بوده و شمارش به کمک لام توما تعداد باکتري در هر میلی لیتر را 2/24×109 عدد نشان داد. همچنین اندازه گیري تعداد باکتري هاي زنده بروش CFU نشان داد که در هر میلی لیتر2×109 عدد باکتري زنده وجود دارد. که این امر حاکی از مناسب بودن محیط مالت براي رشد و بقاي باکتري است.
یکی از مهمترین عوامل در قیمت تمام شده پروبیوتیک تولیدي قیمت مواد اولیه می باشد. عصاره مخمر یک ماده گرانقیمت بوده و هرکیلوگرم آن بسته به روش تولید و کیفیت محصول بین 9 تا 160 دلارقیمت داشته و تنها انواع گرانقیمت تر که به روش آنزیمی هیدرولیز شده اند براي تامین نوترینت هاي مورد نیاز لاکتوباسیل ها مناسبند.[4] پروتئوز پپتون و عصاره گوشت نیز گرانقیمت هستند و در فرمولاسیون اغلب محیط کشت هاي صنعتی تنها از عصاره مخمر استفاده میشود. با توجه به نتایج فوق در محیط ام آر اس به ازاي هر ده گرم ماده غیر قندي یک گرم باکتري تولید شده است. در یک آزمایش دیگر نیز افزودن ده گرم عصاره مخمر به تولید یک گرم جرم خشک سلولی منجرگردید. بطور کلی وزن عصاره مخمر لازم براي تولید هر کیلوگرم باکتري خشک براي گونه هاي مختلف لاکتوباسیل به گونه باکتري، غلظت محیط کشت و شرایط کشت وابسته بوده و در منابع علمی نسبت هاي 5 و در مورد غلظت هاي باکتري کمتر از یک گرم درلیتر حتی 2 نیز گزارش شده اند [5]
در هرحال بنظر میرسد هزینه عصاره مخمر براي تولید هر کیلوگرم لاکتوباسیل بیش از پنجاه دلار بوده و دربرخی موارد به چندصد دلار نیز بالغ گردد. در این تحقیق با استفاده از غلظت 120 گرم در لیتر عصاره مالت تولید شده در آزمایشگاه حدود هفت گرم بر لیتر جرم خشک سلولی و 45 گرم در لیتر اسید لاکتیک تولید شد. بنابراین براي تولید هریک کیلو گرم جرم خشک باکتري 17 کیلو گرم جامدات عصاره مالت مصرف شده است. از طرفی براي تولید هر یک کیلو گرم جامدات عصاره مالت 2/5 کیلو گرم جو مورد نیاز است. بدین ترتیب حدود 42/5 کیلوگرم جو براي تولید هرکیلوگرم جرم خشک باکتري مصرف میشود. درصورتیکه قیمت هر کیلوگرم جو 0/2 دلار فرض گردد هزینه ماده اولیه تولید هرکیلوگرم جرم سلولی حدود 8/5 دلار خواهد بود. به این رقم باید هزینه تبدیل جو به مالت نیز افزوده شده و ارزش جامدات باقیمانده از آن کسر گردد .
دریک تقریب اولیه هزینه تولید هرکیلوگرم جرم خشک سلولی با استفاده از عصاره مالت جو حدود پانزده دلار بوده و بر خلاف عصاره مخمر به منبع کربن جداگانه نیازمند نیست. با توجه به برآورد مقدماتی فوق استفاده از عصاره مالت جو که با فرایند هاي آنزیمی مناسب بهبود یافته باشد میتواند هزینه هاي تولید پروبیوتیک مورد بحث و احتمالا سایر لاکتوباسیل هاي مورد استفاده در کشت هاي آغاز گر و نیز تولید اسید لاکتیک را به میزان قابل توجهی کاهش دهد. پژوهشهاي تکمیلی براي بهینه سازي فرایند تولید عصاره مالت مناسب و بهینه سازي محیط کشت مبتنی بر آن ضرورت دارد.
قدردانی
بدینوسیله از خانم عباسیان و آقاي شفیعی مسئول آزمایشگاه بیوتکنولوژي گروه مهندسی شیمی دانشگاه اصفهان براي همکاري در انجام آزمایشها قدردانی میشود.
