بخشی از مقاله
چکیده
در طی فصل بهار و اوایل تابستان 95 طی بازدید از باغات چند شهر استان آذربایجانغربی - میاندوآب، مهاباد و شاهین دژ - از درختان هستهدار دارای علائم شانکر نمونه برداری شد. برای جداسازی عامل بیماری، ابتدا با استفاده از اسکالپر استریل از محل زخم ها و شانکر ها برشهایی تهیه شد و داخل چند قطره آب استریل، کاملا خرد و له گردیدند. پس از گذشت حدود نیم ساعت در دمای اتاق، یک لوپ از سوسپانسیون حاصل را روی محیط کشت نوترینت آگار - NA - به صورت مخطط کشت شدند. پس از گذشت چند روز تکی کلنی ها انتخاب و پس از کشت دوباره در محیط NA جداسازی DNA از سلولهای باکتریایی به روش لایز قلیایی انجام شد.
برای ردیابی و شناسایی باکتری در اندامهای آلوده به شانکر باکتریایی، ژن مولد توکسین سیرینگومایسین جدایه ها تکثیر شد که همه جدایه ها قطعه ای به طول 750 جفت باز روی ژل آگارز ایجاد کردند. از آنجائیکه سیرینگومایسین و دیگر ایزومرهای آن توکسینهایی با ساختار لیپیدی حلقوی هستند و به وسیله اغلب جدایه های پاتوار Pseudomonas syringae pv. syringae تولید میشود، استفاده از واکنش زنجیرهای پلی مراز و تکثیر ژن مولد سیرینگومایسین به عنوان روشی سریع و مفید در ردیابی این جدایهها مفید و متاسب تشخیص داده شد.
مقدمه
باکتری سودوموناس تنوع زیادی دارد و در اغلب مکانها دیده شده است این باکتری از مناطق سردسیر، گرمسیر، از گیاه، قارچ، جانوران بیمار، آب و خاک جدا سازی شده است. سودوموناسهای بیمارگرگیاهی عامل بیماریهای زیادی با علائم مختلف هستند که شامل شانکر، سرخشکیدگی شاخهها، گلگاه، سوختگی دانه یا برگ، لکهبرگی - پاتوارهای Pseudomonas - syringae، پوسیدگی قهوهای یا نرم P. viridiflava - و پاتوارهای - P. marginalis، گالها یا تومورها - پاتووارهای P. - savastanoi و بلایت قارچ خوراکی - P. tolaasii , P. agarici - هستند. بسیاری ازسودوموناسها به عنوان اپی فیت روی گیاهان هستند
باکتری P. syringae از جمله پاتوژنهای گیاهی است که قادر به آلوده کردن دامنه وسیعی از گونههای گیاهی شامل گیاهان زراعی، باغبانی و زینتی و دارای بیش از پنجاه پاتووار است. این باکتری در سال 1899 به دلیل اینکه اولین بار از یاس بنفش - Syringa vulgaris - 1 جداسازی شده است سرینگه2 نامیده شد. ولی بعدها از جنسها و خانوادههای گیاهی دیگری نیز جداسازی شد
بیماری شانکر باکتریایی در باغات درختان میوه هستهدار در مناطق مختلف استان آذربایجانغربی وجود دارد. در سالهای اخیر در این درختان در استان آذربایجان غربی علایمی مانند بروز شانکر - زخم - و ترشح صمغ دیده میشود که باعث زوال درخت شده و بتدریج با پیشرفت بیماری نهایتا منجر به خشک شدن درختان هستهدار میگردد. همچنین در برخی باغها، ترشح صمغ در ابتدای فصل مشاهده میشود. این بیماری باعث کاهش محصول، ضعفو نهایتاً خشک شدن درختان آلوده می گردد. براساس بررسیهای انجام شده علایم مربوط به بیماری شانکر باکتریایی در درختان هستهدار مخصوصا گیلاس، هلو و شلیل در اکثر مناطق استان دیده میشود.
سودوموناسها سمهایی - 3 توکسین - مانند سیرینگومایسین تولید میکنند که باعث ایجاد منافذ درغشا پلاسمایی میزبان میشود و همچنین تولید ضدمتابولیتهایی - 4مانند تبتوکسین5 و فازئولوتوکسین - 6 میکنند که مانع بیوسنتز آمینواسیدها میشود. سیرینگومایسین توسط پاتووار سیرینگه تولید شده و در کلاس فیتوتوکسینهای حلقوی لیپودپسینوناپپتید7 قرار داد. بیان ژنهای درگیر در بیوسنتز سیرینگومایسین توسط مولکولهای سیگنال گیاه القا میشود که این توکسین موجب نکروز در بافتهای میزبان میشود
اندرت و ریچی - 1984 - دریافتند که سیرینگومایسین با قدرت بیماریزایی جدایههای باکتری Pss در ارتباط است. تولید توکسین با منحنی رشد باکتری ارتباط مستقیم دارد و سیرینگومایسین در انتهای فاز رشدی باکتری Pss تولید میشود - حسن زاده، . - 1374 سیرینگومایسین اغلب از طریق سنجش بیولوژیکی8 روی قارچ Geotrichum candidum شناسایی میشود
زو و گراس - 1988 - نشان دادند که اگر چه P. syringae pv. syringae به صورت اختصاصی با میزبان عمل میکند، اما سیرینگومایسین تولید شده اختصاص به میزبان ندارد و در بسیاری از بیماریها از جمله شانکر باکتریایی درختان میوههسته دار باعث گیاهسوزی میشود
در ایران اولین بار بیماری شانکر باکتریایی روی درختان زردآلو در اصفهان گزارش و میزان خسارت ناشی از آن را 22-25 درصد ذکر گردید - بهار و همکاران، . - 1364 عامل این بیماری روی درختان گیلاس در اطراف تهران پاتووار P. s. pv. syringae تشخیص داده شد - بناپور و همکاران، . - 1369 الهی نیا و رحیمیان - 1994 - باکتری Pss را به عنوان عامل بیماری شانکر درختان میوه هسته دار در منطقه کلاردشت و حومه شناسایی و معرفی نمودند. شمس بخش و رحیمیان - 1997 - نشان دادند جدایههای درختان میوه هستهدار آلوده به شانکر در استان مازندران با مشخصات پاتووار Pss مطابقت دارد.
باتوجه به اینکه این بیماری هرساله خسارت فراوانی به باغهای هسته داران استان آذربایجان غربی وارد میسازد و با توجه به تحقیقات انجام شده به منظور ردیابی سریع تر و دقیق تر بیماری لازم است یک روش مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلی مرارز به کار گرفته شود. با توجه به اینکه اکثر جدایه های عامل بیماری با تولید توکسین باعث شدت بیماریزایی می شوند لذا هدف از این تحقیق نمونه برداری از علائم بیمای شانکر باکتریایی هلو، گیلاس و شلیل در استان آذربایجان غربی و تکثیر ژن مولد سیرینگومایسین جدایه ها به منظور شناسایی و ردیابی باکتریهای عامل بیماری میباشد.
روش تحقیق
نمونه برداری و جداسازی باکتری عامل بیماری
در طی فصل بهار و اوایل تابستان 95 طی بازدید از باغات چند شهر استان آذربایجانغربی - میاندوآب، مهاباد و شاهین دژ - از درختان هستهدار دارای علائم شانکر نمونه برداری شد. بیشتر نمونهبرداریها از سرشاخهها و شاخههای جوان که دارای علائم شانکر همراه با تولید صمغ بودند، انجام شد. نمونه ها داخل پاکت به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه آزاد واحد ملکان منتقل گردیدند. برای جداسازی عامل بیماری، ابتدا با استفاده از اسکالپر استریل از محل زخم ها و شانکر ها برشهایی تهیه شد و داخل چند قطره آب استریل، کاملا خرد و له گردیدند. پس از گذشت حدود نیم ساعت در دمای اتاق، یک لوپ از سوسپانسیون حاصل را روی محیط کشت نوترینت آگار - NA - به صورت مخطط کشت شدند. محیط کشتها به منظور رشد باکتری ها داخل انکوباتور بادمای 26 درجه سانتی گراد قرار داده شدند.
جداسازی DNA ژنومی
جداسازی DNA از سلولهای باکتریایی به روش لایز قلیایی انجام شد . - Arabi et al., 2006 - از استرینها پس از 24 ساعت رشد در محیط NA در دمای 27 درجه سانتیگراد، در آب مقطر استریل استریل سوسپانسیون تهیه شد. کدری سوسپانسیونها در طول موج 600 نانومتر به0/2 واحد تنظیم گردید و به میزان 0/1 حجم آنها هیدروکسید پتاسیم 10 درصد افزوده گردید. نمونهها به مدت 2 دقیقه درون بنماری در دمای جوش قرار داده شدند. شفاف شدن سوسپانسیون به عنوان لایز شدن سلولهای باکتریایی تلقی گردید. سپس نمونهها به مدت 5 دقیقه با سرعت 12هزار دوردر دقیقه سانتریفوژ شدند. سپس لایه رویی از سوسپانسیون را برداشته و در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. از این نمونهها به عنوان DNA الگو در واکنشهای زنجیرهای پلیمراز استفاده شد.
آزمایش تایید استخراج DNA
از روش الکتروفورز در ژل آگارز برای تایید استخراج نمونههایDNA استفاده شد. به منظور این کار یک گرم آگارزدر 100 میلیلیتر بافر TBEحل کرده و درون سینی مخصوص ژل ریخته شد. از همین بافر به عنوان بافر محفظه نیز استفاده گردید.
