بخشی از مقاله
چکیده
مواد افزودنی از جمله موادی هستند که بطور عمدی در فرآیند تولید موادغذایی افزوده شده تا از تغییرات نامطلوب و فساد ناشی از میکروارگانیسمها جلوگیری و باعث افزایش ماندگاری مواد غذایی می شوند لذا اندازهگیری آنها یک مرحله ضروری در کنترل کیفیت مواد غذائی است. در این مطالعه از روش ساده، سریع و قابل اعتماد HPLC، جهت جداسازی و تعیین همزمان نگهدارندهها - بنزوات سدیم وسوربات پتاسیم - در دوغ های پاستوریزه عرضه شده در استان آذربایجانغربی و شرقی استفاده گردید. ابتدا عوامل موثر بر استخراج بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم pH - نمونه استخراجی، حجم حلال استخراجی، میزان محلول کارز، سرعت سانتریفوژ و زمان استخراج - بررسی و شرایط بهینه حاصل گردید.
ارقام تجزیهای شامل محدوده خطی، حد تشخیص، حد تعیین و تکرار پذیری تعیین گردید. این روش بطور موفقیتآمیز در اندازهگیری 10 نمونه دوغ عرضه شده در استان آذربایجانغربی و شرقی استفاده گردید و مشخص شد که متاسفانه این نوع نگهدارندهها به منظور جلوگیری از رشد میکروارگانیسمها در اکثر دوغهای تولیدی استان آذربایجانغربی و شرقی مصرف میشوند، درحالی که حد مجازی برای مصرف آنها در نظر گرفته نشده است. لذا تحقیق حاضر میتواند گامی موثر برای تدوین استاندارد و تعیین حد مجاز مصرف نگهدارندههای بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم در دوغ باشد.
کلمات کلیدی: بنزوات سدیم، سوربات پتاسیم، دوغ، کروماتوگرافی مایع با کارائی بالا، استان آذربایجانشرقی و غربی.
.1 مقدمه
فرآوردههای لبنی به علت بالا بودن مواد مغذی و رطوبت نسبی، محیط مناسبی برای رشد میکروارگانیسم محسوب میشوند. نگهدارندهها مواد شیمیایی طبیعی یا مصنوعی هستند که به محصولات غذایی جهت افزایش زمان مصرف آنها افزوده میشود. این ترکیبات از رشد میکروارگانیسم هایی از قبیل کپک، مخمر و باکتری جلوگیری می کنند. به علاوه، مواد نگهدارنده میتوانند واکنشهای ناشی از قرار گرفتن مواد غذایی در معرض اکسیژن، گرما و برخی یون ها را نیز کنترل نمایند .[1] بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم از انواع نگهدارندهها هستند که بیش از همه در غذاهای اسیدی استفاده میشوند .[2] با توجه به اثرات مخرب این نوع نگهدارندهها بر سلامت مصرفکنندگان، دقت و نظارت بر کاربرد نگهدارندهها در مواد غذاییکاملاً ضروری میباشد.
مکامیزم اثر سوربات پتاسیم و بنزوات سدیم به منظور جلوگیری از رشد میکروارگانیسمها بدین گونه است که بنزوئیک اسید از فعالیت باکتریایی جلوگیری نموده و سوربیک اسید به عنوان یک ماده ضدقارچی در کپک و مخمر مصرف میشود. بنزوات در pH پایین و اسیدی شدن محیط داخل سلولی از مهمترین عوامل مهار رشد و تکثیر مخمر و کپک است؟ سلولهای مخمر و کپک برای رشد و تکثیر نیاز به ATP دارند. اسیدی شدن محیط داخل سلولی آنزیم فسفوفروکتوکیناز که در چرخه تولید ATP نقش دارند، غیرفعال میکند. این موضوع سبب افزایش تقریبی در غلظت - Adenosine diphosphate - ADP و افزایش نسبی در غلظت - Adenosine monophosphate - AMP میگردد و در نهایت رشد و تکثیر مخمر و کپک کاهش یافته یا متوقف میشود.
سوربات با مهار آنزیمهای دهیدروژناز در اکسیداسیون اسیدچرب، عمل خود را انجام میدهد؟ همچنین آنزیمهای دارای سولفیدریل محل اثر سوربات در میکروارگانیسمها است. سوربات با مهار آنزیمهای حاوی سولفیدریل باعث جفت نشدن فسفو ریلاسیون اکسیداتیو می گردد؟ مهار کاتالاز در کپکها روش دیگر فعالیت سوربات در نظر گرفته شده که در نتیجه آن با افزایش هیدروژن پراکسید در سلول عمل میکند .[3] بر اساس قوانین بین المللی غذا و دارو، - Food and - Drug Association, FDA افزودنیهای غذائی فقط در صورتی که به عنوان سالم و بیضرر - Generally Recognized - as Safe بوده و روی بر چسب ماده غذائی این مطلب ذکر - GRAS - شده باشد، مجاز هستند.
به عنوان مثال، بنزوات سدیم تا غلظت %0/1 ولی سوربات پتاسیم تا حدود %0/1-0/2 مجاز هستند .[4] بررسیهای تحقیقاتی نشان دادهاند که بنزواتسدیم آثار سوئی مانند گرانولاسیون شدید پوست و حتی آسیبهای جدی در سلول های مغزی، کاهش وزن بدن، تغییراتی در یونهای پلاسما و حتی در مواردی مرگ را موجب شده است. از طرف دیگر، در پژوهشهای دیگری که صورت گرفته، مشخص شده است که سدیم بنزوات فعالیت دو آنزیم آسپارتات آمینوترانسفراز و آلکالین فسفاتاز را افزایش میدهد که این امر سبب آسیب به کلیه و کبد شده و در مواردی تخریب طحال نیز مشاهده شده است. همچنین استفاده طولانی از سوربات پتاسیم به واکنشهای حساسیتی، تهوع، اسهال و از دست رفتن مواد مغذی در غذا منجر میشود .[5]
دوغ نوشیدنی حاصل از تخمیر لاکتیکی شیر است که ماده خشک آن از راه رقیق کردن ماست دوغسازی - پس از تخمیر - یا شیر دوغسازی - پیش از تخمیر - استاندارد شده باشد .[6] دوغ به علت pH پایین و غنی بودن از مواد مغذی به خصوص در دمای محیط، مستعد آلودگی با کپکها و مخمرها و بعضی از باکتریها میباشد که موجب تغییر طعم و آروما و بادکردگی محصول در طول زمان نگهداری آن میشود .[7] این موضوع به عنوان یک چالش مهم در صنعت لبنیات مطرح است، بنابراین استفاده از مواد نگهدارنده مناسب برای حفظ کیفیت و افزایش ماندگاری دوغ همگام با بهبود طعم و افزایش بازارپسندی آن، از اهمیت ویژهای برخوردار است. سوربات پتاسیم و بنزوات سدیم نگهدارندههایی هستند که بهمنظور افزایش ماندگاری و کاهش بار میکروبی به دوغ اضافه میشوند.
روشهای مختلفی جهت اندازهگیری سوربات پتاسیم و بنزوات سدیم در مواد غذایی گزارش شده است که میتوان به روش کروماتوگرافی مایع [8-13]، الکتروفورز لوله موئین 15]و [14، اسپکتروفتومتری [16]، کروماتوگرافی گازی-اسپکترومتر جرمی [17]، کروماتوگرافی مایع با میکرواستخراج فاز جامد [18] و کروماتوگرافی مایع با میکرواستخراج مایع-مایع پخشی [19] اشاره نمود. HPLC یک روش سریع، قابل اعتماد و تکرارپذیر برای اندازه گیری و ردیابی این گونه افزودنیها در موادغذائی است .[20-22] تاکنون هیچ تحقیقی به منظور ردیابی این نگهدارندهها در نوشیدنی دوغ در منطقه استان آذرباجان شرقی و غربی انجام نشده است. لذا در این تحقیق هدف، ردیابی و اندازهگیری این نوع نگهدارنده ها در دوغ پاستوریزه در سطح استان آذرباجان شرقی و غربی با روش ساده و معتبر HPLC است تا ضمن آگاهی مسئولین و سازمانهای ذیربط، زمینه برای کنترل و تعیین حد مجاز این نوع نگهدارندهها در این نوشیدنی ملی مهم فراهم گردد.
.2 مواد و روشها
.1-2 مواد شیمیائی و استانداردها
استاندارد بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم از شرکت سیگما آلدریچ آمریکا - Sigma-Aldrich - ، هیدروکسید سدیم با خلوص 98/5، هگزا سیانوفرات - پتاسیم با خلوص بیش از 98 درصد، استات روی با خلوص بیش از 98 درصد، اسید استیک گلاسیال، اسید سولفوریک و متانول، استونیتریل و آب با درجه HPLC و با بالاترین درجه خلوص و سایر مواد شیمیائی از شرکت مرک آلمان - Merck - تهیه گردید. جهت تهیه محلولهای مادر از بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم با غلظت 1000 ppm ابتدا مقدار 0/1 گرم از هر کدام را به دقت وزن کرده و در بالن ژوژه 100 میلی لیتری و در دمای 20-25 درجه سانتیگراد با استونیتریل به حجم رسانده میشود. سپس با استفاده از محلول مادر و به روش رقیق سازی محلولهای استاندارد کاری روزانه با غلظتهای مختلف بدست میآید.
.2-2 تجهیزات
دستگاه HPLC مدل Agilent 1260 با سیستم کنترل مدل CBM-20A، پمپ گرادیانت مدل LC-20AD، سیستم تزریق دستی با حجم لوپ 25 میکرولیتر، دتکتور فتو دیود اری - PDA - مدل SPD-M20A و ستون C18 اکتادسیل سیلان - ODS - با مشخصات 100 میلی متر طول و قطر ستون 4/6 میلی متر و اندازه دانه های سیلیکاژل 5 میکرون به همراه ستون محافظ بود. ترازوی دقیق آزمایشگاهی مدل سارتریوس با دقت 0/0001 گرم، دستگاه سانتریفوژ انیورسال ساخت ایران مدل 3488، دستگاه pH متر مدل 760 متراهم سوئیس، سرنگ هامیلتون جهت تزریق 20 میکرولیتر نمونه به دستگاه HPLC و میکروفیلتر مدل Millex HV 0.45 ʽm - Millipore - بود.
.3-2 تهیه فاز متحرک
فاز متحرک شامل استونیتریل با درجه HPLC و بافر استات با pH برابر 3/6 به نسبت 1:1 و سرعت جریان فاز متحرک 1/2 میلی لیتر در دقیقه.
.4-2 نمونه ها
تعداد 10 نمونه دوغ پاستوریزه تولید شده ازسطح کارخانجات استان آذربایجان غربی و شرقی با تاریخ تولیدهای مختلف، به صورت تصادفی و از ابتدای فصل بهار 1394 تا ابتدای فصل تابستان 1394 جمع آوری شدند تا از نظر سوربات پتاسیم و بنزوات سدیم مورد بررسی قرار بگیرند. البته سعی شد تا تعداد نمونه یک کارخانه با حجم تولید آن واحد تناسب داشته باشد. از هر کارخانه تعداد 1 تا 3 نمونه بر اساس حجم نمونه در دسترس به صورت تصادفی از کلیه 10 کارخانه فعال تولید کننده دوغ آذربایجان غربی و شرقی جمع آوری شدند. این واحدهای تولیدی در شهرهای مهاباد، ماکو، خوی، سلماس، بوکان، ارومیه، میاندوآب، بناب و ملکان قرار دارند. سعی بر آن است که نمونههایی انتخاب شوند که حداکثر 48 ساعت از تولید آنها گذشته باشد. نمونههای دوغ بعد از انتقال به آزمایشگاه تا زمان آنالیز در یخچال در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. آنالیز همه نمونهها سه بار تکرار شد.
.5-2 فرایند استخراج بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم از دوغ
بهمنظور استخراج بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم، 2 میلیلیتر دوغ و 6 میلیلیتر هیدروکسید سدیم 0/1 مولار را به یک فالکن 50 میلیلیتر منتقل کرده سپس کاملا همگن نموده، تا استخراج بنزوات سدیم و سوربات پتاسیم به درون فاز آبی بهخوبی انجام شود. 1 میلیلیتر اسید سولفوریک 0/5 مولار، 1 میلیلیتر استات روی و 1 میلیلیتر پتاسیم هگزاسیانوفرات به آن اضافه شد. بعد از همگن کردن و انجام سانتریفوژ، فاز شفاف فوقانی را جدا کرده و از صافی 0/45 میکرومتر فیلتر عبور داده و 20 میکرولیتر از فاز فوقانی حاصل به دستگاه تزریق شد.
