بخشی از مقاله
بررسی نقش جهش های ﮊن BRCA1 در سرطان پستان تکگیردر شهر کرمانشاه
چکیده
زمینه و هدف: سرطان پستان مهمترین نئوپلاسم در زنان است که سبب مرگ و میر در اغلب کشورهای پیشرفته و خیلی از کشورهای در حال توسعه است. با توجه به افزایش روزافزون وقوع سرطان پستان در ایران، تحقیقات مولکولی در این زمینه ضروری به نظر میرسد. در مطالعات بسیاری موتاسیونهای ﮊن BRCA1 در سرطان پستان وراثتی مورد بررسی قرار گرفته است ولی میزان بروز سرطان پستان غیروراثتی بر خلاف سرطان پستان فامیلی بسیار بالاست. هدف اصلی این مطالعه شناخت نقش جهش ﮊن BRCA1 در سرطان پستان تکگیر (Sporadic) میباشد.
روش بررسی: برای مشخصکردن موتاسیون ﮊنهای BRCA1 از تکنیک PCR-SSCP استفاده شده است. ۰۳ عدد بلوک پارافینی بافت پستان از بیماران مبتلا به سرطان پستان که در بیمارستان امام رضا (ع) و بیمارستان طالقانی شهر کرمانشاه تحت جراحی قرار گرفتند جمعآوری شد. سپس بلوکها جهت بررسی مشخصات تومور، با تهیه لام از نمونههای بافتی، توسط پاتولوﮊیست تحت مطالعه قرار گرفتند. بررسی موتاسیون در اگزونهای ۵، A۱۱ و B۱۱ ﮊن BRCA1 با استفاده از تکنیک PCR-SSCP و رنگآمیزی نیترات نقره آمونیاکی انجام شد. آزمون مورد استفاده در تحلیل دادهها، آزمون مربع کای پیرسون بود.
یافتهها: ۰۲% بیماران (۶ بیمار) دارای جهش بودند، به این صورت که از ۰۳ نمونه مورد مطالعه ۳/۳۱% (۴ بیمار) در اگزون ۵ و ۷/۶% (۲ بیمار) در اگزون B۱۱ دارای جهش بودند. جهشی در اگزون A۱۱ در نمونههای مورد بررسی مشاهده نشد. نتیجهگیری: نتایج به دست آمده از این تحقیق نشان میدهد که جهش در اگزونهای ۵ و B۱۱ ﮊن BRCA1 در پیشرفت سرطان پستان غیروراثتی در این بیماران نقش دارد.
کلید واﮊهها: سرطان پستان، ﮊن BRCA1، جهش، ریسک فاکتور، تشخیص مولکولی وصول مقاله: ۷۱/۷/۷۸ اصلاحیه نهایی: ۱/۹/۸۸ پذیرش مقاله: ۷۱/۰۱/۸۸
مقدمه
ریسک فاکتورهای اصلی در مورد سرطان پستان غیر وراثتی معمولاﹰ ناشی از مسائل هورمونی هستند. به عنوان مثال میتوان جنس، سن شروع قاعدگی و یائسگی، سابقه باروری، تغذیه نوزاد از پستان و استفاده از استروﮊن اگزوﮊن (با منشأ خارجی) را نام برد. در اغلب مـوارد، سرطان پستـان غیر وراثتـی، در زنان یائسـه اتفاق میافتد و بیان بالای استروﮊن رسپتور (ER) در آنها دیده میشود. استروﮊن، حداقل ۲ نقش اصلی در ابتلای به سرطان پستان ایفا میکند: ۱- متابولیتهای استروﮊن میتوانند موتاسیون یابند و یا رادیکالهای آزاد آسیبزننده به DNA تولید کنند (۱). ۲- استروﮊن از طریـق فعالیت هورمونی خود که تکثیر سلولی است سبب ازدیاد سلولها در ضایعات پیشسرطانی و سرطانها میشود. در عین حال، با توجه به اینکه گروه مهمی از کارسینوماهای پستان، -ER منفی هستند، قطعاﹰ مکانیزمهای دیگری هم در تکوین سرطان پستان نقش دارند (۲). جهش BRCA1، خطر احتمال ابتلا به سرطان پستان در طول زندگی را تا سن ۰۵ سالگی، به ۱۵% و تا سن ۰۷ سالگی به ۵۸% و نیز خطر احتمال ابتلا به سرطان تخمدان در طول زندگی را تا سن ۰۵ سالگی به ۳۲% و تا سن ۰۷ سالگی به ۳۶% میرساند (۳).
ﮊن BRCA1 طولی معادل kb۰۰۱ را روی کروموزوم 17q21 اشغال میکند و واجد ۴۲ اگزون است. mRNA آن kb ۸/۷ است و پروتئینی با ۳۶۸۱ اسیدآمینه را تولید مینماید (۴). ﮊن BRCA1 مجاور مارکر D17S855 است. اگزون ۱۱ آن بسیار طولانی بوده و kb ۷/۶ طول دارد. اگزون ۱ این ﮊن در سطح mRNA نسخهبرداری نمیشود و اگزون ۴ نیز در واقع توالی Alu میباشد (۵). تجلی ﮊن BRCA1 تحت تنظیم پیچیدهای است، در تنظیم تجلی آن، دو مسأله حائز اهمیت و تأثیرگذار است؛ اول اینکه رونوشت آن تحت کنترل دو پروموتر است که دو رونوشت متمایز α و βرا تولید میکنند و دوم اینکه پروموتر α با ﮊن NBR2 که مجاور آن است مشارکت کرده و این دو همراستا عمل میکنند. نکته جالب توجه در تجلی BRCA1 آن است که هر دو پروموترهای α و β، پاسخگو به تحریک استروﮊن هستند و این، پیشنهاد میکند که BRCA1 ممکن است در مسیرهای پیامرسانی هورمونی دخیل باشد (۶ و۳).
اگرچه هویت کامل و فعالیت پروتئین BRCA1 هنوز شناخته نشده است، شواهد زیادی دال بر فعالیت تنظیمی منفی تکثیر سلولی تومور وجود دارد. ممانعت تجلی و بیان BRCA1 با بهرهگیری از الیگونوکلئوتیدهای آنتیسنس باعث توقف تکثیر سلولهای نرمال و نیز سلولهای بدخیم اپیتلیال شد. BRCA1 در ترمیم DNA وکنترل چرخه سلول نقش دارد. از زمان ایزوله شدن ﮊن BRCA1 بیش از ۰۰۵ تغییر توالی در ناحیه کدکننده ﮊن مشخص شده است. بیشتـر از ۰۰۱ جهش با نفـوذ بالا نیـز در سرطانهای پستان گزارش شده است (۷). بیشتر این جهشها از نوع تغییر قاب خواندن١ است که با تکنیکهای تشخیصی ٢SSCP، ٣ PTT و توالییابی مشخص شدهاند. بیشتر این جهشها منجربه ایجاد پروتئین BRCA1 کوتاه میشوند بعضی از این جهشها از نوع missense میباشند که این جهشها منجر به نقص در عملکرد پروتئین میشوند (۸).
بعضی جهشها مختص مناطق جغرافیایی خاصیاند از آنها میتوان به عنوان جهشهای اثرگذار٤ در آن مناطق نامبرد. در مورد ﮊن BRCA1 در سرطان پستان نیز جهشها مختص مناطق جغرافیایی خاص مشاهده شده-است. به عنوان مثال میتوان از جهش اگزون ۲ ﮊن BRCA1 در یهودیان اشکنازی (۹)، جهش اگزونهای ۷ ۱۱ در زنان هندی (۰۱)، جهش اگزون ۳۱ در نژاد آفریقایی- آمریکایی (۱۱) و جهش اگزون ۱۱ در ناحیه آمریکای شمالی (۲۱) نام برد.
روش بررسی
نمونه گیری
نوع مطالعه تحقیقی- تحلیلی و جامعه آماری شامل نمونههای بررسی شده از بین بیماران مبتلا به سرطان پستان بود که در بیمارستانهای امام رضا و طالقانی کرمانشاه طی سالهای ۱۸ تا ۵۸ تحت جراحی قرار گرفته بودند. برای جمعآوری نمونهها ابتدا پرونده پاتولوﮊی بیماران بررسی گردید و۰۳ نمونه براساس گزارش پاتولوﮊی که دارای داکتال کارسینوما و لوبولار کارسینوما بودند و همچنین واجد خویشاوند دارای سرطان پستان نبودند انتخاب شد. پس از انتخاب بیماران مورد نظر از بلوکهای بافتی پارافینه بیماران اسمیر لام تهیه شد و پس از رنگآمیزی هماتوکسیلین- ائوزین، لامها توسط پاتولوﮊیست مورد مطالعه قرار گرفت و جهت بررسیهای بعدی درجه تمایز تومور نمونهها توسط پاتولوﮊیست گزارش شد.
استخراج DNA از بافت توموری با روش کلرید سدیم اشباع
به منظور بررسی جهش در اگزونهای ۵، A۱۱ و B۱۱ ﮊن BRCA1، استخراج DNA از ۰۳ نمونه جمعآوری شده صورت گرفت. قطعات µm ۵۲-۰۲ از بلوک پارافینی تا ضخامت ۵/۰ میلیمتر با دستگاه میکروتوم جدا و با گزیلل و اتانول در دو مرحله عاری از پارافین شد، به اینصورت که در مرحله اول تنها از گزیلل و در مرحله دوم از گزیلل و مقدار کمی اتانول استفاده شد و بعد از هر مرحله فاز رویی دور ریخته شد. به این قطعات ۳ میلیلیتر از بافر لیزکننده و ۵۲ میکرولیتر SDS اضافه و سپس به مدت ۴۲ ساعت در محیط با دمای oC۰۵ قرار داده شد . در ادامه پس از اضافه شدن پروتئیناز K مدتی به وسیله تکاندهنده١ مخلوط شد و برای ۴۲ ساعت در دمای oC۰۵ انکوبه گردید. سپس ۳/۱حجم لوله به آن NaCl ۶ مولار اضافه و مخلوط برای ۰۳ دقیقه در دور rpm ۰۰۵۳ سانتریفوﮊ گردید.
سپس همحجم فاز مایع رویی جدا شده، محلول ایزوپروپانول سرد اضافه و خوب مخلوط شد. در ادامه به مدت ۵۱ دقیقه با دور rpm ۰۰۰۲۱ سانتریفوﮊ گردید تا DNA رسوب نماید، رسوب جدا شده پس از ۲ بار شستشو با اتانول ۰۷% در ۰۵ میکرولیتر بافر TE حل شد. برای غیر فعال کردن پروتئیناز K محلول برای ۰۱ دقیقه در دمای oC۵۹ و سپس سریعﹰا روی یخ قرار داده شد. به منظور اطمینان از وجود DNA در نمونههای حاصل از استخراج، ۲-۱ میکرولیتر از آن در آگارز ۸/۰ درصد الکتروفوزر شد و با دستگاه UV illumination کمیت DNA استخراجی آن مورد بررسی قرار گرفت.
روش انجام PCR
ابتدا در هر میکروتیوب ۵/۰ میلیلیتری، ۰۲ میکرولیتر از مخلوط واکنش PCR ریخته و به آن ۱ میکرولیتر از آغازگرهای٢ رقیق شده (به نسبت Pmol/μl ۰۱) مربوط به اگزونهای مورد نظر اضافه شد. آغازگرهای مورد استفاده در این تحقیق مربوط به سه ناحیه مختلف از ﮊن BRCA1 و متعلق به اگزونهای ۵ وA ۱۱ وB ۱۱ میباشد که توالی آنها در جدول ۱ آمده است. میزان آنزیم DNA پلیمراز اضافه شده ۵/۰ واحد برای هر واکنش است. در ادامه ۲ میکرولیتر از DNA ﮊنومی هر بیمار به مخلوط واکنش اضافه گشته کاملاﹰ مخلوط گردید. پس از انجام یک سانتریفوﮊ کوتاه و سریع، برای جلوگیری از تبخیر نمونهها در حرارت دستگاه، حدود ۰۲ میکرولیتر روغن معدنی به هر میکروتیوب اضافه گردید. این بار نیز یک سانتریفوﮊکوتاه دیگر انجام شد و نمونهها در دستگاه مولد چرخههای حرارتی٣ قرار گرفتند تا با تنظیم دستگاه روشن نمودن آن واکنش زنجیرههای پلیمراز آغاز گردد. برای اطمینان از صحت عمل بخصوص در مورد مراحل بعدی، استفاده از کنترل مثبت که DNA یک فرد سالم میباشد ضروری است. دما و زمان مناسب برای واسرشتی DNA، ۴۹ درجه سانتیگراد به مدت ۲ دقیقه برای تکثیر DNA ۲۷ درجه سانتیگراد به مدت ۵۴ ثانیه می باشد. دما و زمان مناسب برای اتصال هر یک از آغازگرها در جدول ۱ آمده است. پس از ۷۳ چرخه حرارتی تعداد زیادی از نسخه مورد نظر را خواهیم داشت که برای مشاهده نتیجه PCR، الکتروفورز محصولات ضروری است.
الکتروفورز SSCP
این روش میتواند در مورد جهشهای شناخته و ناشناخته مورد استفاده قرار گیرد. در این مرحله ابتدا قطعات دورشتهای DNA واسرشته شده و بر روی ﮊل پلیاکریلآمید غیر واسرشتهکننده الکتروفورز میگردند. حرکت تکرشتهها برحسب پیوند بین بازها و ایجاد اشکال فضایی صورت میگیرد. برای این منظور، ۵ میکرولیتر از محصولات PCR با ۵ میکرولیتر بافر SSCP مخلوط شد و بعد از یک سانتریفوﮊ سریع، ۰۲ میکرولیتر روغن معدنی بر روی هرکدام ریخته شد. سپس به مدت ۵ الی ۷ دقیقه در دمای oC۵۹ قرار گرفت تا رشتههای DNA واسرشت شود. برای جلوگیری از اتصال مجدد رشتهها به یکدیگر بلافاصله به داخل یخ و سپس دمای oC۴ انتقال داده شد. سپس ۸ میکرولیتر از هر نمونه داخل چاهکهای ﮊل اکریلآمید- بیساکریلآمید۰۱%، در کنار یک شناساگر وزن مولکولی DNA، یک کنترل منفی و یک نمونه غیر واسرشته، قرار گرفت. الکتروفورز در مدت ۳ ساعت با ولتاﮊ ۰۴۱ ولت انجام پذیرفت. ﮊل به روش نیترات نقره آمونیاکی رنگ آمیزی (۳۱) و سپس مورد بررسی قرارگرفت. با توجه به اینکه در SSCP احتمال خطا بالا است ممکن است با توجه به تغییر شرایط و حساس بودن فوقالعاده این روش الگوهای حرکتی متفاوتی نشان دهد بنابراین بر روی محصولات PCR مربوط به اگزونهای هر یک از بیماران حداقل ۳ بار الکتروفورز SSCP در شرایط یکسان انجام شد. جابجایی یک قطعه در شرایط محیطی انتخاب شده یکسان ﮊل ممکن است در روزهای مختلف تغییر کند. بنابراین جابجایی ضرورتاﹰ در بین ﮊلهای مختلف قابل تکرار نمیباشد ولی در بین خطوط متفاوت یک ﮊل منفرد قابل تکرار است که در مورد اگزون B۱۱ در شکل ۵ نشان داده شده است. از این رو دستهای از قطعات DNA با توالی مشابه که در یک ﮊل الکتروفورز میشوند اگر دارای الگوی حرکتی یکسانی باشند و دارای اختلاف در موقعیت نوارهای DNA نسبت به کنترل سالم باشند به عنوان یک نمونه مظنون به جهش تلقی میگردند.
در این روش هر نمونه که دارای اختلاف در موقعیت نوارهای DNA نسبت به کنترل سالم باشد به عنوان یک نمونه مظنون به جهش تلقی میگردد.
یافته ها
نمونه گیری و انتخاب بیمار
۰۳ بیمار مبتلا به سرطان پستان مورد بررسی زن بودند و طبق اطلاعات بدستآمده هیچ یک از خویشاوندان آنها مبتلا به سرطان پستان نبودند، بنابراین فرض میشود که سرطان پستان در آنها از نوع تکگیر بوده است. پس از انتخاب بیماران مورد نظر از بلوکهای بافتی پارافینه بیماران اسمیر لام تهیه شد و پس از رنگآمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، لامها توسط پاتولوﮊیست مورد مطالعه قرار گرفت و جهت بررسیهای بعدی درجه تمایز تومور نمونهها توسط پاتولوﮊیست گزارش شد.
مشخصات پاتولوﮊیک جمعآوری شده از پروندههای بیماران شامل اندازه تومور، درگیری غدد لنفاوی و وضعیت گیرنده استروﮊن است که در مورد بیماران واجد جهش در اگزونهای مورد بررسی در جدول ۲ آمده است.
استخراج DNA از بافت توموری و برتری روش کلرید سدیم اشباع
به منظور بررسی جهش در اگزونهای ۵، A۱۱وB۱۱ ﮊن BRCA1، استخراج DNA از ۰۳ نمونه جمعآوری شده صورت گرفت. برای آنکه بتوان از وجود DNA در نمونه های حاصل از استخراج، اطمینان حاصل نمود ۲-۱ میکرولیتر از آن ، در آگارز ۸/۰ درصد الکتروفوزر شد و با دستگاه UV illumination کمیت DNA استخراجی آن مورد بررسی قرار گرفت. استخراج DNA ﮊنومی از بلوک پارافینی با روش کلرید سدیم اشباع نسبت به روشهای استخراج DNA در مقالات دیگر نظیر روش فنل- کلروفرم (۴۱) و روش استات سدیم (۶۱و۵۱) دارای برتریهایی است. از جمله این که مقدار DNA بیشتری استخراج می شود و کیفیت DNA استخراج شده بالا میباشد و همچنین طول قطعات DNA ﮊنومی بدست آمده بلندتر است یعنی DNA ﮊنومی با این روش در مراحل استخراج DNA کمتر خرد میشود.
محصولات PCR و الکتروفورز آنها
اندازه محصولات PCR با استفاده از نرم افزار UVdoc. مشخص شد. نتایج به دست آمده در شکلهای ۲،۱ و ۳ نشان داده شده است.
پس از انجام PCR برای اطمینان از موفق بودن آن محصولات PCR را باید الکتروفورز کرد. به علت کوچکی اندازه قطعات مورد نظر در این مرحله از ﮊل آگارز ۲% استفاده شد. پس از انجام الکتروفورز و بررسی ﮊل با نورUV از آن عکسبرداری شد و سپس با استفاده از نرم افزار UVdoc. اندازه محصول PCR مشخص شد. بدین صورت بعد از حصول اطمینان از موفقیت آمیز
