بخشی از مقاله
چکیده این تحقیق با هدف بررسی اثر غلظت های مختلف ملاتونین به عنوان آنتی اکسیدان قوی - 0، 0/1، 1، 2، 3 و 4 میلی مولار - بر ویژگی های اسپرم گاو نر هلشتاین پس از فرایند انجماد- یخ گشایی انجام پذیرفت. نمونه های منی از 4 گاو نر جمع آوری و با رقیق کننده سیترات - زرده تخم مرغ به همراه غلظت های مختلف ملاتونین رقیق و تا 5 درجه سانتی گراد سرد و سپس در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شدند. پس از یخ گشایی ویژگی های جنبایی کل، زنده مانی و مرفولوژی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده رقیقکننده حاوی سطوح مختلف ملاتونین نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری - P<0/05 - باعث تغییر صفات جنبایی،زندهمانی و درصد اسپرمهای دارای مرفولوژی غیرطبیعی میشود. غلظت 2میلیمولار همراه با غلظت 1 میلیمولار بیشترین افزایش - P<0/05 - را در درصد جنبایی کل و کاهش اسپرم با موفولوژی غیرطبیعی داشته و همراه با غلظت 3 میلیمولار موجب بیشترین افزایش در درصد زندهمانی شده است. غلظت 4 میلیمولار با اینکه به صورت معنیداری - P<0/05 - باعث بهبود جنبایی کل و کاهش اسپرم با مورفولوژی غیرطبیعی نسبت به گروه شاهد شده است ولی در سایر صفات تاثیر معنیداری در نداشته است. نتایج حاصل از این مطالعه استفاده از غلظت 2 میلی مولار ملاتونین در رقیق کننده برای انجماد منی گاو را پیشنهاد می کند.
واژگان کلیدی: ملاتونین، آنتی اکسیدان، اسپرم گاو، محافظت از انجماد، ویژگی های کنتیکی
مقدمه در سیستم های صنعتی پرورش گاو، تلقیح مصنوعی نقش مهمی در کنترل تولید مثل دارد. در سطح مزرعه، کنترل تولید مثل ، همزمانسازی زایش در یک دوره زمانی و تغذیه تکمیلی برای فراهم کردن نیازهای شیردهی را تسهیل کرده و موجب افزایش تعداد نتاج به ازای هر راس دام نر میشود. تلقیح مصنوعی مهمترین فنی است که برای اصلاح ژنتیکی حیوانات ارائه شده است .
انجماد و ذخیره اسپرم، شامل قراردادن اسپرم در ازت مایع و در نتیجه توقف واکنشهای متابولیکی آن است. با کاهش و یا توقف متابولیسم اسپرم طول عمر باروری آنها افزایش مییابد و در نتیجه میتوان از آنها برای مدت زمان طولانیتری استفاده نمود.
حفظ انجمادی اسپرم تغییرات فراساختاری، بیوشیمیایی و عملکردی را در غشای اسپرم به وجود میآورد که در نتیجه آن زندهمانی اسپرم را بعد از انجماد-ذوب تحت تاثیر قرار میدهد - . - 1
غشای پلاسمایی اسپرم دارای اسیدهای چرب غیراشباع زیادی است و بنابراین برای جلوگیری آسیب پراکسیداسیون، به ویژه هنگام محافظت انجمادی، استفاده از آنتی اکسیدانها لازم است. این آسیب پراکسیداتیو موجب کاهش یکپارچگی غشا، آسیب به عملکرد سلول، کاهش جنبایی و کاهش توانایی باروری اسپرم برای تلقیح مصنوعی می شود. یکی از عواملی که میتواند موجب تخریب غشای پلاسمائی، اختلال در حرکت و دیگر فعالیتهای اسپرماتوزوئیدها شود، رادیکالهای آزادند. آنتیاکسیدانها از ترکیباتی هستند که فعالیت رادیکالهای آزاد را کاهش میدهند - - 2 اسپرماتوزوا به دلیل داشتن اسید چرب غیراشباع در غشا مورد
حمله پراکسیدازها قرار گرفته و این واکنش پرکسیدازی منجر به شکست اسیدهای چرب غیراشباع و تولید محصولات تغییر یافته اکسیداتیوی میشود که برای سلول کشنده است. مکانیسمهای متفاوتی برای مهار استرس اکسیداتیو و کاهش آسیب های ناشی از گونه های اکسیژن فعال وجود دارد که یکی از آنها استفاده از آنتیاکسیدان در محیط است به همین دلیل به رقیقکننده باید آنتیاکسیدان اضافه شود. در چندین سال اخیر توانایی نفوذ ملاتونین در عملکرد سیستم ایمنی بدن، جلوگیری از رشد سرطان وخواص آنتی اکسیدانی آن در از بین بردن رادیکالهای آزاد کشف شده است - 3 - بنابراین در این مطالعه اثرات افزودن ملاتونین به مایع رقیقکننده را بر روی کیفیت اسپرم پس از ذوب بررسی گردید. مواد و روش ها نمونه های منی سه روز در هفته به وسیله مهبل مصنوعی از 4 راس گاو هلشتاین واقع درمرکز اصلاح نژاد شمال غرب و غرب کشور جمع آوری شده و پس از انتقال به آزمایشگاه نمونه های نرمال انتخاب شده و سپس از نمونههای منی هر دام به یک مقدار مساوی مخلوط و با رقیق کننده سیترات-زرده تخم مرغ رقیق شد. در رقیقسازی از روش دومرحلهای استفاده شده است .بعد از ارزیابی اولیه، نمونه های منی گاو برای رسیدن به غلظت 100 میلیون اسپرماتوزوآ در هر سی سی ابتدا با رقیق کننده A رقیق شده و بعد از اعمال تیمار ملاتونین - 0، 0/1، 1، 2، 3 و 4 میلی مولار - در لولههای آب هم دما قرار داده شده و به یخچال5 C انتقال داده شده تا دمای نمونههای منی به آرامی به 5 C برسد، سپس به مقدار مساوی با حجم رقیق کننده A، از رقیق کننده B که حاوی 11 درصد گلیسرول میباشد افزوده شده تا غلظت نهایی گلیسرول به 7 درصد برسد. بعد از سپری شدن نیم ساعت، نمو نهها توسط دستگاه فیلینگ- سیلینگ در پایوتهای 0/5سی سی پر و بستهبندی شده است. پایوتها که قبل از بستهبندی توسط چاپگر مخصوص برای تیمارها و تکرارهای مشخص نامگذاری شده بودند روی رکهای مخصوص انجماد چیده شده و برای انجماد به دستگاه نیمه اتوماتیک انجماد اسپرم انتقال داده میشدند.دمای دستگاه انجماد در-70 C تنظیم و ثابت شده و بعد از انتقال رکهای حاوی پایوتهای منی رقیق شده به دستگاه، درب دستگاه بسته شده و شیب انجماد به گونهای تنظیم شد که دمای محفظه حاوی پایوتها در عرض 10دقیقه از -70 C به -150 C برسد. بعد از سپری شدن این زمان پایوتها توسط گوبلت های مخصوص علامتگذاری شده برای هر تیمار به تانک ازت -196 C انتقال مییافتند. هنگام یخ گشایی از حمام آب گرم 37 C به مدت 45 ثانیه استفاده می شد. از سیستم آنالیز رایانهای تحرک اسپرم برای ارزیابی جنبایی ، رنگ آمیزی ائوزین-نیگروزین برای ارزیابی زنده مانی و از محلول هانکوک برای شمارش اسپرمهای غیرطبیعی و اسپرمهای دارای آکرزوم غیرطبیعی استفاده شد. این آزمایش با 5 تکرار انجام شده و دادههای حاصل به صورت جداگانه در قالب طرح کامل تصادفی و به کمک رویه Proc GLM نرمافزار SAS تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج
رقیقکننده حاوی سطوح مختلف ملاتونین نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری - P<0/05 - باعث تغییر صفات جنبایی،زندهمانی و درصد اسپرمهای غیرطبیعی می شود.
جدول.1 مقایسه صفات جنبایی، زندهمانی ، مورفولوژی غیرطبیعی و آکروزوم غیرطبیعی اسپرم یخگشایی شده گاو در بین سطوح
آزمایشی ملاتونین - میلیمولار -
غلظت 4 میلیمولار با اینکه به صورت معنیداری - P<0/05 - باعث بهبود جنبایی کل و کاهش اسپرم با مورفولوژی غیرطبیعی نسبت به گروه شاهد شده است ولی در سایر صفات تاثیر معنی داری در نداشته است - . - P>0/05 غلظت 2میلی مولار همراه با غلظت 1 میلیمولار بیشترین افزایش - P<0/05 - را نیز در درصد جنبایی کل و کاهش اسپرم با موفولوژی غیرطبیعی داشته و همراه با غلظت 3 میلیمولار موجب بیشترین افزایش در درصد زندهمانی شده است. سطح یک میلیمولار همچنین موجب افزایش معنیدار - P<0/05 - زندهمانی و یکپارچگی غشای پلاسمایی نسبت به گروه شاهدمیشود. سطح 0/1میلیمولار نیز موجب بهبود معنیدار - P<0/05 - جنبایی کل و پیشرونده، زندهمانی،یکپارچگی غشای پلاسمایی و کاهش درصد اسپرمها با مورفولوژی غیرطبیعی میشود. بحث مطالعات روی اسپرم گاو - - 4 و اسب - - 5نشان داد که فرایند محافظت از انجماد موجب افزایش تولید گونههای اکسیژن فعال میشود. در منی گاو مشاهده شد که پلاسمای منی رقیق شده یک منبع مهم آنتیاکسیدانی است که اسپرم را در فرایند محافظت از انجماد، علیه استرس اکسیداتیو محافظت میکند - . - 6 تولید بیش از حد گونه اکسیژن فعال میتواند آسیبهای جدی بر ساختار و عملکرد اسپرم وارد کند - - 7 به این دلیل از آنتیاکسیدانهای خارجی علاوه بر آنتیاکسیدانهای موجود در پلاسمای منی در رقیق کننده انجماد اسپرم استفاده شده و توانایی آن ها در بهبود کیفیت و عملکرد اسپرم بعد از فرایند انجماد-یخگشایی گزارش شده است . - 8 - بنابراین شواهد غیرمستقیمی وجود دارد که استرس اکسیداتیو در طی فرایند محافظت از انجماد به سلول اسپرم آسیب وارد میکند. تاثیر حفاظتی ملاتونین در سلولهای مختلف موجب شده اثر آنتیاکسیدانی ملاتونین کاملا مشهود شود. ملاتونین مستقیما تعداد زیادی از رادیکال های آزاد سمی را غیرفعال کرده - - 11-9، در بیان ژنهای آنزیمهای آنتیاکسیدانی موثر بوده و موجب افزایش سطح mRNA وپروتئینهای این آنزیمها میشود - - 12 ملاتونین همچنین میتواند اسپرماتوزوا را علیه جیوه ، نیتریک اکساید ، H2O2 و آسیب های اکسیداتیو محافظت کند - . - 13 گاوائی و برنارد - 2002 - گزارش کردند که ملاتونین بر اساس دوزهای مورد استفاده جنبایی اسپرم را تحت تاثیر قرار میدهد - . - 14 فوجی نوکی - 2008 - مشاهده کرد که استفاده ار ملاتونین در شرایط آزمایشگاهی موجب افزایش فعالیت اسپرم موش میشود که سطح 1 نانومولار موثرترین دوز میباشد . - 15 - کاساسو - 2010 - گزارش کرد که استفاده از غلظت 0/001 میلیمولار ملاتونین موجب بهبود ظرفیتپذیری و کاهش تغییرات شبه آپاپتوزی میشود، در حالی که در سطوح پایینتر اثرات محافظتی ملاتونین مشاهده نمیشود - . - 16
