بخشی از مقاله
چکیده
فرآیند انجماد اسپرم باعث بروز آسیب های ساختاری و بیوشیمیایی در اسپرم می شود که می تواند زنده مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار داده و موجب افزایش تولید گونه های اکسیژن فعال و ایجاد شرایط استرس اکسیداتیو می شود. لذا
هدف این مطالعه بررسی اثر آنتی اکسیدانی سطوح مختلف هورمون ملاتونین 0,1 - ، 1، 2، 3 و 4 میلی مولار - در رقیق کننده
اسپرم گاو می باشد. نمونه های منی از 4 گاو نر جمع آوری و با رقیق کننده سیترات - زرده تخم مرغ به همراه غلظت های مختلف ملاتونین رقیق و تا 5 درجه سانتی گراد سرد و سپس در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شدند. پس از یخ گشایی ویژگی های جنبایی پیشرونده، یکپارچگی غشای پلاسمایی، ظرفیت آنتی اکسیدانی تام و میزان پراکسیداسیون لیپید مورد بررسی قرار گرفت. اساس یافته های حاصل از مطالعه ما ،غلظت 2 میلیمولار ملاتونین همراه
با غلظت 1 میلیمولار بیشترین افزایش - P<0/05 - را نیز در درصد جنبایی پیشرونده و همراه با غلظت 3 میلیمولار موجب
بیشترین افزایش در یکپارچگی غشای پلاسمایی شده است.سطوح 1 و 2 میلی مولار ملاتونین بیشترین افزایش را در ظرفیت
آنتی اکسیدانی تام داشته و غلظت های 1، 2 و 3 میلی مولار ملاتونین موجب کاهش معنی دار - - P<0/05 تولید مالون دی
آلدهاید نسبت به گروه شاهد شده که سطح 2 میلی مولار ملاتونین بیشترین کاهش را در پراکسیداسیون لیپید موجب شده است.
واژگان کلیدی: ملاتونین- آنتی اکسیدان- اسپرم گاو- انجماد- استرس اکسیداتیو مقدمه
هدف از انجماد اسپرم به کاربردن آنها در تکنیکهای کمک کننده به تولیدمثل بوده که در این تکنیک ها، منی پس از انزال، به طور مستقیم وارد دستگاه تولید مثل ماده نشده بلکه پس از تحریک دام نر و جمعآوری منی توسط مهبل مصنوعی، اسپرم رقیق شده و
به منظور نگهداری طولانی مدت به صورت سردسازی یا منجمد، با روشهایی مانند قرار دادن در دستگاه تولیدمثل ماده، اضافه نمودن به محیط کشت درآزمایشگاه جهت باروری اووسیت بالغ و یا انتخاب یک اسپرم جنبا و سالم از نظر مرفولوژی، جهت
تزریق درون سیتوپلاسمی اووسیت مورد استفاده قرار میگیرد. لذا استفاده از اسپرم طبیعی و کارآمد در این تکنیکها ضروری و
روشهای به کاربرده شده جهت غنیسازی سلول اسپرم، نقش مهمی را در پیشرفت این تکنیک ها برعهده خواهد داشت - . - 1 غشای پلاسمایی اسپرم، مدل کامل و عالی جهت بررسی اثر عوامل خارجی مختلف، روی غشاها بوده و نقش بیولوژی منحصر به فردی را در فرایندباروری ایفامیکند. انجماد و یخگشایی، تکامل غشای اسپرم را افزایش و منجر به واکنش آکروزومی سلول اسپرم
شده، همچنین فرایندظرفیتپذیری وواکنش آکروزمی، جنبایی اسپرم را تحت تاثیر قرار داده، از طرفی عمر و توانایی آن را در
واکنش با دستگاه تولید مثل ماده و باروری کاهش میدهد .فرایند انجماد اسپرم،با تشکیل گونه های اکسیژن فعال وبا استرس و
آسیبهای اکسیداتیوی همراه بوده که از عوامل مهم، در کاهش جنبایی و باروری اسپرم در طول نگهداری منی محسوب می-
شوند - . - 3-2 غشای پلاسمایی اسپرم حاوی مقدار زیادی اسید چرب غیراشباع و فاقد ترکیبات سیتوپلاسمی آنتی اکسیدانی بوده ، بنابراین مستعد به آسیبهای پراکسیداسیون لیپیدی - - 3-2توسط رایکالهای آزاد مثل هیدروژن، پراکسید، آنیون سوپر اکسید و
هیدروکسیل بوده که با کاهش سلامت غشا، کاهش جنبایی اسپرم، و آسیب عملکرد سلولی همراه می باشد - . - 3 ایجاد تعادل بین
تولید رادیکالهای آزاد و فراوردههای گروههای واکنش اکسیژنی و سمزدایی آنها توسط آنتیاکسیدانها،یک عامل مهم در بقای
سلول اسپرم و عملکرد آنها، قبل و بعد از حفاظت انجمادی میباشد که بههم خوردن این تعادل باعث استرس اکسیداتیوی می-
شود. استفاده از آنتی اکسیدان در رقیق کننده یکی از روش های استرس اکسیداتیو می باشد. مطالعات زیادی بر خاصیت آنتی اکسیدانی ملاتونین تاکید کرده - 5-4 - و تاثیر مثبت آن در حفاظت از اسپرم در طی فراوری را گزارش کرده اند . - 7-6 - لذا در این مطالعه تصمیم گرفتیم تاثیر آنتیاکسیدانی ملاتونین را در تقویت سیستم آنتیاکسیدانی پلاسمای منی و حذف رادیکالهای آزاد
هنگام فراوری اسپرم مورد بررسی قرار دهیم. مواد و روش ها
نمونه های منی سه روز در هفته به وسیله مهبل مصنوعی از 4 راس گاو هلشتاین واقع درمرکز اصلاح نژاد شمال غرب و غرب کشور جمع آوری شده و پس از انتقال به آزمایشگاه نمونه های نرمال انتخاب شده و سپس از نمونههای منی هر دام به یک مقدار مساوی مخلوط و با رقیق کننده سیترات-زرده تخم مرغ رقیق شد. در رقیقسازی از روش دومرحلهای استفاده شده است. بعد از
اعمال تیمار ملاتونین - 0، 0/1، 1، 2، 3 و 4 میلی مولار - . پایوتها بعد از بستهبندی به یخچال 5 درجه منتقل شده و بعد از سپری شدن زمان سردسازی و تعادل، با قرار گرفتن در بخار ازت مایع به مدت 15 دقیقه منجمد شده و به ازت مایع انتقال داده شدند. هنگام یخ گشایی از حمام آب گرم 37 C به مدت 45 ثانیه استفاده می شد. از سیستم آنالیز رایانهای تحرک اسپرم برای ارزیابی
ویژگی های جنبایی و از تست التهاب هیپو-اسموتیک به منظور ارزیابی یکپارچگی غشای پلاسمایی استفاده شد. برای انجام آزمایشات بیوشیمیایی ابتدا هموژن سلولی تهیه شده و سپس پراکسیداسیون لیپیدی با استفاده از تیوباربیتوریک اسید%0/67 و تریکلرواستیک اسید % 20 اندازه گیری شد. 0/5میلیلیتر از هموژنه سلولی به 1 میلیلیتر محلول فوق اضافه و سپس به مدت 1 ساعت در دمای جوش قرار داده شده و سپس جذب محلول رویی در طول موج 532 نانومتر اندازهگیری شد. نتایج با استفاده از
استاندارد مالون دی آلدهاید به صورت - نانو مول در دسی لیتر - بیان گردید. برای اندازهگیری پتانسیل آنتیاکسیدانی تام با مکانیسم
FRAP از روش بنزی و استرین استفاده شد.به همین منظور ابتدا محلول کار FRAP به قرار زیر تهیه گردید. میزان 10میلیلیتر
بافر استات - - pH=3.6,300mmol/l با 1 میلیلیتر از ماده تری پیریدیل تریازین محلول در اسید کلریدریک - 40mmol/l -
مخلوط شده و 1 میلیلیتر محلول کلریدفریک - 20mmol/l - به آن اضافه شده و سپس به یک میلیلیتر محلول کار میزان 100
میکرولیتر سوپرناتانت حاصل از هموژن سلولی اضافه و جذب آن درطول موج 593 نانومتر به مدت 4 دقیقه اندازهﲜگیری گردید . پس از کسر جذب بلانک، جذب حاصله با استفاده از استاندارد ویتامین C به صورت میکرومولار ویتامینC بیان گردید - - 8 این
آزمایش با 5 تکرار انجام شده و دادههای حاصل به صورت جداگانه در قالب طرح کامل تصادفی و به کمک رویه Proc GLM
نرمافزار SAS تجزیه و تحلیل شدند.
نتایج
رقیقکننده حاوی سطوح مختلف ملاتونین نسبت به گروه شاهد به طور معنیداری - P<0/05 - باعث تغییر جنبایی و یکپارچگی
غشای پلاسمایی میشود. غلظت 4 میلیمولار با اینکه به صورت معنیداری - P<0/05 - باعث بهبود یکپارچگی غشای پلاسمایی
نسبت به گروه شاهد شده است ولی درصد جنبایی پیشرونده را کاهش داده است - . - P>0/05 غلظت 2میلیمولار همراه با غلظت 1 میلیمولار بیشترین افزایش - P<0/05 - را نیز در درصد جنبایی پیشرونده داشته و همراه با غلظت 3 میلیمولار موجب بیشترین
افزایش در درصد یکپارچگی غشای پلاسمایی شده است.
مقایسه جنبایی، یکپارچگی غشای پلاسمایی، پتانسیل آنتیاکسیدانی تام و میزان تولید مالون دی آلدهاید در اسپرم یخگشایی شده
گاو همراه باسطوح آزمایشی ملاتونین
بالانویسها a - ،b،cو - d در یک ردیف نشاندهنده تفاوتهای معنیداری در سطح P<0/05 بین تیمارها میباشد
با اندازه گیری میزان پتانسیل تام آنتی اکسیدانی ظرفیت آنتی اکسیدانی مشخص می شود. تغییرات میزان پتانسیل تام آنتی اکسیدانی در اثر اعمال تیمارنسبت به گروه شاهد، نشان دهنده خاصیت آنتی اکسیدانی ماده افزوده شده است. نتایج حاصل از این مطالعه همچنین نشان میدهند که حضور ملاتونین در رقیق کننده اسپرم گاو موجب افزایش معنیدار - P<0/05 - پتانسیل آنتیاکسیدانی
تام شده و میزان تولید مالون دی آلدهاید کاهش - P<0/05 - می یابد که نشان دهنده کاهش پراکسیداسیون لیپید اسپرم است. در
این بین سطوح 1 و 2 میلی مولار ملاتونین بیشترین افزایش را در ظرفیت آنتیاکسیدانی تام داشته و اختلاف بین گروه شاهد و سطح 4میلیمولار ملاتونین معنیدار نمیباشد - P>0/05 - ، همچنین غلظتهای 1، 2 و 3 میلیمولار ملاتونین موجب کاهش معنیدار تولید مالون دی آلدهاید شده است که سطح 2 میلیمولار ملاتونین بیشترین کاهش را در پراکسیداسیون لیپید موجب شده است.
بحث مشاهده بیشترین افزایش در عملکرد اسپرم منجمد گاو در حضور ملاتونین بیان می کند که سطح 2 میلیمولار ملاتونین میتواند به
عنوان موثرترین سطح استفاده از ملاتونین در رقیق کننده انجماد اسپرم گاو باشد.در مطالعهای که توسط
انجام شد، گزارش شد که نقش محافظتی ملاتونین روی میتوکندری و به طبع آن روی جنبایی اسپرم میتواند از طریق چندین
مکانیسم باشد. مکانیسم - 1 خاصیت آنتیاکسیدانی و جاروب کننده رادیکالهای آزاد توسط ملاتونین، اندامکهای سلول را در برابر آسیبهای استرس اکسیداتیو محافظت میکند - . - 9 مکانیسم - 2 ملاتونین موجب افزایش فعالیت کمپلکسهای 1 و 4 در شاخههای انتقال الکترون شده، در نتیجه موجب بهبود تنفس میتوکندریایی و افزایش تولید ATP تحت شرایط طبیعی و استرس
