بخشی از مقاله
چکیده
این پژوهش، با هدف بررسی اثر غلظتهاي مختلف ال-کارنیتین در رقیقکننده بر پایه تریس-زرده تخممرغ بر فراسنجههاي تحرك، زندهمانی، سلامت غشاي پلاسمایی و ناهنجاري مورفولوژیکی اسپرم گاو هلشتاین انجام شد. براي انجام این آزمایش، منی دو راس گاو هلشتاین با متوسط وزن 1200±100 کیلوگرم مخلوط شده و سپس تحت 3 تیمار با غلظتهاي 5 و 10 میلیمول ال-کارنیتین LC5 - ، - LC10 و یک گروه به عنوان شاهد، پس از فرایند انجماد-یخگشایی با استفاده از طرح کاملا تصادفی قرار گرفت. طبق آزمایشهاي انجام شده، تیمار 10 میلیمول ال-کارنیتین، بالاترین میزان تحرك معنیدار اسپرم را نسبت به گروه شاهد نشان داد . - P<0/05 - در ارتباط با زندهمانی اسپرم، تیمار 10 میلیمول ال-کارنیتین بهترین اثر معنیدار را به همراه داشت . - P<0/05 - بر اساس نتایج سلامت غشاي پلاسمایی، مشاهده شد که تیمارهاي ال-کارنیتین با 5 و 10 میلیمول موجب بهبود معنیداري در این فراسنجه شدند . - P<0/05 - به عنوان نتیجهگیري کلی میتوان بیان نمود که بهترین سطوح ال-کارنیتین با تیمار LC10 مشاهده شد. بنابراین جهت بهبود در فراسنجههاي کیفی اسپرم گاو هلشتاین میتوان این تیمار را مورد استفاده قرار داد.
مقدمه
تلقیح مصنوعی مهمترین فنی است که براي بهنژادي حیوانات ارائه شده است. با بکارگیري این فناوري، تنها با چند راس حیوان نر انتخابی، میتوان اسپرم مورد نیاز براي تلقیح هزاران حیوان ماده تامین کرد . - Holt , 2000 - موفقیت در تلقیح مصنوعی متاثر از عوامل متعددي میباشد که یکی از اصلیترین و کلیديترین آنها دسترسی به اسپرمهاي بارور بعد از فرایند انجماد-یخگشایی میباشد. ذخیره و نگهداري مناسب اسپرم، انتقال موفقیتآمیز اسپرم را از مناطق دورتر تسهیل کرده و گسترش استفاده از ذخایر ژنتیکی بهتر را امکانپذیر میسازد . - Baily et al, 2000 - منی منجمد به طور گسترده در تلقیح مصنوعی مورد استفاده قرار میگیرد، اما فرایندهاي انجماد و یخگشایی، موجب ایجاد رادیکالهاي آزاد اکسیژن میشوند که تحرك بعد از یخگشایی، قابلیت زندهمانی، فعالیت آنزیمی درون سلولی، باروري و عملکرد اسپرم را مختل میکند . - Bansal and Bilaspouri, 2011 - فرایند انجماد اسپرم با ایجاد شوك سرمایی باعث کاهش تحرك اسپرم، یکپارچگی غشاء و آکروزوم و عملکرد میتوکندري میشود .
آسیبها را میتوان با بهبود سرد کردن، یخگشایی و استفاده از رقیقکنندههاي مناسب کاهش داد . - Noakes, 2011 - رقیقکننده فاکتور مهمی طی انجماد میباشد که بایستی مقادیر کافی از pH، ظرفیت بافري و خواص اسمزي داشته و اسپرماتوزوآ را از شوك سرمایی محافظت نماید. تقویت رقیقکننده منی با افزودنیهاي مناسب، خسارات اکسیداتیو اسپرماتوزوآي گاو و گاومیش را طی انجماد-یخگشایی کاهش میدهد . - Ansari et al, 2011 - تحرك و قابلیت باروري اسپرماتوزوآ میتواند با افزودن عوامل بهبود دهندهي تحرك یا آنتیاکسیدانها بهبود یابد . - Strzezek, 2002 - سلولهاي اسپرم برعلیه تولید رادیکالهاي آزاد اکسیژن به سیستم دفاع قوي آنتیاکسیدانی مجهز شدهاند . - Sikka, 1996 - انواع مختلفی از آنتیاکسیدانها جهت مبارزه با رادیکالهاي آزاد اکسیژن در پستانداران مورد آزمایش قرار گرفتهاند .
- Aitken, 1994 - آنتیاکسیدانها خط مقدم مبارزه علیه رادیکالهاي آزاد اکسیژن هستند . - Osawa and Kato, 2005 - ال-کارنیتین یک آمین چهار تایی با وزن مولکولی پایین است که به آسانی در آب حل شده و داراي دو ایزومر L و D است . - Lien et al, 2001 - در سال 1955، نقش ال-کارنیتین در متابولیسم چربیها کشف شد - Friedman and . - Fraenkel, 1995 عملکرد اولیه ال-کارنیتین، انتقال و افزایش ورود اسیدهاي چرب بلند زنجیر از سیتوپلاسم به ماتریکس میتوکندري براي عمل بتا اکسیداسیون است .
- Abuzaid, 2010 - ال-کارنیتین یک آنتیاکسیدان بسیار قوي بوده که میتواند دسترسی به لیپیدها را براي اکسیداسیون - با انتقال اسیدهاي چرب به داخل میتوکندري براي بتا اکسیداسیون و تولید - ATP کاهش دهد . - Rani and Pannerselvam, 2002 - مکملسازي ال-کارنیتین سبب افزایش فعالیت آنتیاکسیدانتهاي آنزیمی - سوپراکسید دیسموتاز و گلوتاتیون پراکسیداز - و میزان آنتیاکسیدانتهاي غیر آنزیمی - ویتامینهاي E و - C میشود - Kalaselvi and . - Pannerselvam, 1998 آنزیمهاي آنتیاکسیدانی که اشاره شد براي حفظ تحرك و زندهمانی اسپرماتوزوآ طی انجماد داراي اهمیت میباشند . - Fridoich, 1985 - ترکیبات لیپیدي در غشاي اسپرم در حقیقت فاکتور تعیینکننده براي حساسیت به سرما، تحرك و زندهمانی اسپرماتوزوآ میباشند . - Kelso et al , 1997 - ال-کارنیتین میتواند با کمک سوپراکسید دیسموتاز براي محاصره لیپیدهاي غشاي اسپرم به کار رود. بنابراین، سبب کاهش پراکسیداسیون لیپیدها و محافظت از سلولها در برابر خسارات پراکسیداسیونی گردد . - Forman and Thurston, 1981 - مکملسازي ال-کارنیتین در اسپرم گاو، تحرك اسپرم و سلامت DNA بهبود میبخشد، در حالیکه ناهنجاريهاي اسپرم را کاهش میدهد - Bucak et al , 2010 - و از غشاي اسپرم در برابر متابولیتهاي سمی O2 محافظت میکند . - . - Neuman et al, 2002 - به طور کلی با توجه به خواص آنتیاکسیدانی ال-کارنیتین، میتوان آن را جهت بهبود در فراسنجههاي کیفی اسپرم گاو هلشتاین طی انجماد، مورد استفاده قرار داد.
مواد و روشها
پژوهش حاضر در اسفند ماه 1396 هجري شمسی، در دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی خوزستان و مرکز تولید مواد ژنتیکی دام و طیور خوزستان واقع در شهر ملاثانی در 37 کیلومتري شمال شرقی اهواز انجام شد. تعداد گاوهاي هلشتاین نر مورد مطالعه 2 راس با متوسط وزن 1200±100 کیلوگرم بود که در یک جایگاه مسقف باز با کف بتونی نگهداري میشدند. جایگاه داراي آخور و آبشخور مجزا میباشد. جیرهي دامها متشکل از یونجه خشک، کاه و تفاله نیشکر و کنسانتره بود. جهت جلوگیري از کمبود احتمالی مواد معدنی، بلوك لیسیدنی در اختیار دامها قرار گرفت. در این پژوهش، رقیقکننده بر پایه تریس مورد استفاده قرار گرفت. ترکیبات این رقیقکننده شامل: تریس - هیدروکسی متیل آمینو متان - ، فروکتوز، اسید سیتریک، زرده تخممرغ و آب مقطر بود - ایوانز و ماکسول، . - 1987 براي تهیهي بافر تریس، مقدار 3/876 گرم تریس، 2/123 گرم اسید سیتریک، 0/523 گرم فروکتوز
واحد بینالمللی پنیسیلین و 100 میلیگرم استرپتومایسین را به 100 میلیلیتر آب مقطر اضافه کرده سپس زرده تخممرغ به میزان 16 سیسی به رقیقکننده اضافه شد. اسپرمگیري با استفاده از واژن مصنوعی انجام شد. پس از اسپرمگیري و جمعآوري نمونههاي منی استحصال شده، نمونهها باهم مخلوط شده و با رقیقکننده تریس رقیق شدند. بلافاصله پس از رقیقسازي، نمونههاي منی به 3 قسمت تقسیم و به هرکدام از آنها سطوح مختلف ال-کارنیتین 0 - ، 5 و 10 میلی مول - افزوده شد و پس از بستهبندي در پایوتهاي 0/5 میلیلیتري و گذراندن دوره تعادل، فرایند انجماد بوسیله دستگاه اپرافریزر که دماي آن با ازت تنظیم میشود، تا دماي -145 درجه سانتیگراد صورت گرفت و در مرحله آخر در ازت مایع با دماي منفی -196 درجه سانتیگراد غوطهور شدند. براي یخگشایی منی، پس از خارج کردن پایوتها از ازت، پایوتها به مدت 30 ثانیه در فلاسک آب با دماي 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. پس از یخگشایی نمونهها، بررسی پارامترهاي کیفی اسپرم شامل تحرك، زندهمانی، سلامت غشاي پلاسمایی و ناهنجاريهاي مورفولوژیکی انجام گرفت.
جهت بررسی درصد تحرك اسپرم، یک قطره از نمونه اسپرم زیر میکروسکوپ نوري متصل به مانیتور و نرم افزار CASA مشاهده شد. اساس کار این نرم افزار به این صورت است که نرم افزار پس از شمارش 200 اسپرم، درصد تحرك را مشخص مینماید. براي بررسی درصد زندهمانی ابتدا یک قطره از منی رقیق شدهي تیمارها با رنگ ائوزین-نگروزین مخلوط - نسبت 1 به - 1 شد و پس از 30 ثانیه روي لام توسط لام دیگر گسترش تهیه شد و با جریان هواي گرم خشک شد. پس از خشک شدن گسترش تهیه شده، لامها با بزرگنمایی 1000 توسط میکروسکوپ نوري و نیز با استفاده از روغن ایمرسیون مورد ارزیابی قرار گرفته شدند. درصد اسپرمهاي زنده و مرده در چند میدان از لام - با شمردن حداقل 200 اسپرم در هر اسلاید - تعیین شد. اسپرمهاي مرده به دلیل تغییر در ساختمان غشاء، رنگ ائوزین را به خود جذب کرده و به رنگ صورتی مشاهده شدند. اسپرمهاي زنده رنگ را به خود جذب نکرده و به رنگ سفید ماندند. براي ارزیابی درصد اسپرمهاي ناهنجار، نمونه کوچکی از منی رقیقشده تیمارها روي لام با رنگ ائوزین-نگروزین قرار گرفت و با لام دیگر گسترش تهیه شد. پس از رنگآمیزي حداقل 200 اسپرم در هر لام با بزرگنمایی 1000 میکروسکوپ نوري مورد ارزیابی قرار گرفت. اسپرمهاي ناهنجار شامل اسپرمهایی که در قسمتهاي سر، قطعه میانی و دم اسپرم دیده شدند و شامل سرهاي جدا شده از دم یا سرهاي بدون دم، دم گره کفشی، جدا شدن آکروزوم از سر و غیره باشند.
براي ارزیابی سلامت غشاي اسپرم از تست التهاب هیپوسموتیک استفاده میشود. براي این کار، یک قطره از نمونههاي منی هر کدام از تیمارها و 4 قطره از محلول هیپوسموتیک را روي لام ریخته و پس از مخلوط شدن اقدام به تهیه گسترش میشود. پس از 30 دقیقه با خشک شدن گسترش در دستگاه آون با دماي 37 درجه سانتیگراد، با استفاده از میکروسکوپ نوري با بزرگنمایی 40 حداقل در 5 میدان دید، 200 عدد اسپرم بررسی شد. اسپرمها به محیط هیپوسمول به صورت تورم در دم واکنش نشان میدهند. در این حالت اسپرمهاي با دم گره خورده به عنوان اسپرمهاي با غشاي پلاسمایی سالم و اسپرمهاي با دم صاف به عنوان اسپرمهاي با غشاي پلاسمایی معیوب تلقی میشوند. نتایج بدست آمده از پژوهش حاضر، با استفاده از نرم افزار آماري SPSS در قالب طرح کاملا تصادفی مورد آنالیز قرار گرفت. تجزیه و تحلیل دادهها با استفاده از آنالیز واریانس و مقایسه میانگین تیمارها با آزمون چند دامنهاي دانکن با احتمال معنیداري 5 درصد صورت گرفت.
