بخشی از مقاله
ظرفیت آنتی اکسیدانی خرچنگ آبی (portunus pelagicus) و اثر آن در مهار
استرس هاي اکسیداتیو در محیط آزمایشگاهی
چکیده :
امروزه نقش و اهمیت سیستم دفاع آنتی اکسیدانی بدن انسان در پیشگیري از بروز بسیاري از بیماریهاکاملاً به اثبات رسیده است از سوي دیگر لزوم تقویت این سیستم دفاعی غیر قابل اجتناب است با توجه به این که مصرف آنتی اکسیدانهاي سنتتیک عوارض سوء متعددي را در پی دارد متخصصین همواره ، استفاده از آنتی اکسیدانهاي طبیعی را توصیه می نمایند در این راستا تحقیقات گسترده جهت یافتن منابع طبیعی نوین و تأمین نیازهاي آنتی اکسیدانی انسان در حال انجام است نتایج بسیاري از پژوهشها نشان داده است که آبزیان منابع غنی از آنتی اکسیدان ها می باشند در این تحقیق خرچنگ شناگر آبی از این حیث مورد بررسی قرار گرفت استخراج فراکسیونهاي آنتی اکسیدانی از عصاره بافت عضلانی این گونه ، ظرفیت آنتی اکسیدانی قابل توجهی را نشان داد بعلاوه فراکسیونهاي آنتی اکسیدانی این گونه اثرات قابل توجهی را در مهار استرسهاي اکسیداتیو از جمله مهار همولیز گلبول قرمز و حفاظت از گروههاي تیول خون را در محیط آزمایشگاهی نشان داد .
کلمات کلیدي : ظرفیت آنتی اکسیدانی ، خرچنگ آبی ،.portunus pelagicus استرسهاي اکسیداتیو
مقدمه :
بدن انسان در حالت سلامت داراي یک سیستم تعادلی مابین رادیکالهاي آزاد و میزان آنتی اکسیدانهاست هر عاملی که موجب بروز اختلال در تعادل فوق گردد می تواند بروز برخی از بیماریها را سبب شود . از جمله آترواسکلروزیس ، سرطان ها و پیري زودرس ، تحقیقات سالهاي اخیر لزوم تقویت سیستم آنتی اکسیدانی بدن را از طریق تغذیه و یا مکملهاي غذایی و دارویی نشان می دهد اگر چه در اواخر قرن بیستم منابع گیاهی بعنوان تنها منابع طبیعی آنتی اکسیدانی معرفی می شوند طی دهه ي اخیر تحقیقات گسترده بر روي آبزیان نشان داد که برخی گونه هاي گیاهی و جانوري دریایی مقادیر قابل توجهی از ترکیبات آنتی توموري ، آنتی ویروسی و آنتی اکسیدانی را دارا هستند ، در این تحقیق خرچنگ آبی خلیج فارس از نظر ظرفیت آنتی اکسیدانی مورد بررسی قرار گرفت بدین منظور بافت عضلانی گونه ي فوق جداسازي و در محیط بافري هموژنایز گردید سپس هموژنایز بافت عضلانی خرچنگ آبی جهت استخراج آنتی اکسیدانها طی مراحل ترسیب با سولفات آمونیوم و سپس از آن دیالیز و آبگیري قرار گرفت ، عصاره انتهاي مسیر فوق بوسیله ژل سفادکس جی 100 ، کروماتوگرافی ستونی گردید از بین 170 فرکشن انتهاي ستون که 10 فراکسیون که حداکثر میزان آنتی اکسیدان را داشتند ، بوسیله سلولز
DEAE کروماتوگرافی یونی شدند از 150 فراکسیون حاصل ، سپس از بررسیهاي فراکسیونی که ماکزیمم توتال آنتی
1
اکسیدان را داشت انتخاب شده و در 5 غلظت مختلف جهت سنجش میزان اثر بخشی در مهار آسیبهاي اکسیداتیو بکار رفت در این بخش از مدل گلبولهاي قرمز انسانی استفاده شده و اثر بخشی فراکسیونهاي آنتی اکسیدانی خرچنگ آبی در مهار همولیز اریتروسیت انسانی و نیز در میزان حفاظت از گروههاي تیول خون بررسی و محاسبه گردید ، آزمایشات نشان داد که آنتی اکسیدانهاي خرچنگ آبی در سطح معنی داري قادر به مهار همولیز اریتروسیت هاي انسانی و نیز حفاظت از گروههاي تیول خون هستند با توجه به نتایج این تحقیق خرچنگ آبی بعنوان یک منبع غنی از آنتی اکسیدانهاي طبیعی معرفی می گردد که می توان از آن بعنوان یک منبع بیوتکنولوژي دریایی در تولید کمپلکسهاي غذایی و ترکیبات دارویی جهت پیشگیري از بروز و درمان بیماریهایی که پاتوژنز آنها رادیکالهاي آزاد هستند استفاده نمود .
مواد و روشها :
صید خرچنگ بوسیله تور ترال و گوشگیر از منطقه صیادي بحرکان (سواحل خلیج فارس . استان خوزستان) انجام شد نمونه ها بلافاصله در یخ انکوبه و به آزمایشگاه انتقال یافت ، نمونه ها تشریح شده ، بافت عضلانی جداسازي و به بافر تریس
%5) ، (PH=7/5 انتقال یافت بافت عضلانی همراه با بافر هموژنایز گردید سپس در سانتریفوژ یخچال دار در دماي 4 0 c براي مدت 10 دقیقه و 6000×g ، سانتریفوژ شد ، لایه رسوبی دور ریخته شد ، لایه ي سوپرناتانت جهت جداسازي پروتئینها به روش ترسیب استفاده شد بدین ترتیب که تحت شرایط همزن مغناطیسی ابتدا با افزودن مقادیر لازم سولفات آمونیوم جامد به سطح اشباع 50 درصد رسید ، پس از سانتریفوژ 6000×g) ، (40c به مدت 30 دقیقه ، رسوب این مرحله ) ) نگهداري شد و به لایه سوپرناتانت مطابق مرحله قبل تا حد اشباع 70 درصد میزان لازم سولفات آمونیوم جامد اضافه شد ، پس از سانتریفوژ رسوب این مرحله ) ) با رسوب مرحله ي قبل ) ) ترکیب شده به میزان هم حجم بافر تریس افزوده پس از مخلوط نمودن ، جهت دیالیز 12 ساعته به کیسه ي دیالیز انتقال یافت (بافر مصرفی طی دیالیز ، بافر تریس بود که هر 2 ساعت تعویض گردید) پس از انجام دیالیز آبگیري توسط سوکروز به مدت 10 ساعت انجام شد در خاتمه محلول حاصل از کیسه دیالیز خارج شده به بشر انتقال یافت و جهت استخراج آنتی اکسیدانهاي احتمالی طی کروماتوگرافی استفاده گردید ، در کروماتوگرافی مرحله اول ستون حاوي سفادکس با قطر دانه هاي 2/5 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتی متر بود ، فاز متحرك بافر تریس نمکی ، سرعت جریان 40 میلی لیتر در ساعت انتخاب گردید ، فرکنشهاي حاصل در انتهاي ستون بوسیله ي دستگاه فرکشن کالکتور ، جمع آوري شد 170) فرکشن) سپس براي تمام فرکشهاي فوق میزان جذب نوري در طول موج
280 نانومتر و 540 نانومتر قرائت گردید و به کمک کیک بیورت میزان پروتئین و به وسیله کیت رندوکس میزان آنتی اکسیدان هر فرکشن محاسبه گردید ، فرکشنهاي 117-122) و 93-97 و 52-58 و (20-26 که حداکثر میزان آنتی اکسیدان را داشتند جهت تخلیص به ستون دوم انتقال یافت در مرحله ي دوم ستون کروماتوگرافی حاوي سلولز DEAE قطر ستون
1/5 سانتی متر و ارتفاع 60 سانتی متر فاز متحرك بافر تریس نمکی ، سرعت جریان 40 میلی لیتر در ساعت بود در انتهاي ستون 150 فرکشن توسط دستگاه کالکتور جمع آوري گردید که مطابق مرحله ي قبل میزان توتال پروتئین و میزان آنتی اکسیدان تمامی فرکشنهاي محاسبه گردید سپس فرکشنهاي 84-89) و 68-71 و 42-48 و 25-27 و (12-16 که حداکثر میزان آنتی اکسیدان را داشتند به روش فیلتر میکروبی ، استریل شده جهت بررسی اثر بخشی در مهار آسیب هاي اکسیداتیو استفاده شدند .
تأثیر آنتی اکسیدانهاي خرچنگ آبی در مهار آسیب هاي اکسیداتیو در محیط آزمایشگاهی :
- مهار لیز گلبولهاي قرمز :
الف – تهیه سوپانسیون گلبولی : خون افراد سالم در لوله ي هپارنیه جمع آوري و سپس به وسیله سانتریفوژ ، گلبولهاي قرمز از پلاسما جدا گردید ، Rbc هاي فوق سه بار بوسیله سرم فیزیولوژي شستشو شد نهایتاًو گلبولهاي قرمز خالص تهیه
گردید از اریتروسیت هاي خالص فوق به روش رقیق سازي در بافر فسفات نمکی ، سوسپانسیون 2 درصد (معادل هماتوکریت
(12 تهیه شد .
ب – همولیز گلبولهاي قرمز: از فرکشنهاي آنتی اکسیدانی استریل شده ، لوله هایی با غلظتهاي ( %100 ، %75 ، %50 ، (%25 تهیه شد (رقیق سازي با بافر PBC صورت گرفت) ، سپس لوله هایی شامل :
100 میکرولیتر سوسپانسیون 2،%ٌRBC
700 میکرولیتر بافر فسفات سالین
100 میکرولیتر عصاره فرکشنی آنتی اکسیدانی
100 میکرولیتر 25) AAPH میلی مولار)
آماده پس از مخلوط کردن به مدت 2 ساعت در دماي 370 انکوبه گردید سپس سانتریفوژ (1000×g) به مدت 10 دقیقه انجام شده و میزان جذب نوري لایه فوقانی در طول موج 415 نانومتر قرائت شد (بیانگر میزان همولیز) و با لوله شاهد (فاقد عصاره فرکشنی) از نظر میزان همولیز مقایسه گردید بر این اساس مقادیر درصد مهار همولیز در مجاورت با فرکشنها ، در مقایسه با شاهد که میزان (صد درصد همولیز را نشان می داد) محاسبه گردید .
- حفاظت از گروههاي تیول :
پس از تهیه سوسپانسیون گلبول قرمز ، 50 میکرولیتر از سوسپانسیون Rbc را با 1000 میکرولیتر بافر تریس و 50 میکرولیتر فرکشن آنتی اکسیدانی (از غلظتهاي چهارگانه) ترکیب و میزان جذب نوري در طول موج 412 نانومتر قرائت شد ( ) ،
سپس به لوله ي فوق 20 میکرولیتر معرف 2) DTNB و 2 دي تیونیتروبنزوئیک اسید) افزوده و مدت 30 دقیقه در دماي آزمایشگاه انکوبه و سپس میزان جذب نوري در 412 نانومتر قرائت گردید ( ) ، لوله شاهد نیز شامل بافر تریس سوسپانسیون گلبولی و معرف DTNB آماده و جذب نوري آن در 413 نانومتر قرائت گردید (B) سپس مقادیر جذب نوري قرائت شده در فرمول زیر قرار گرفت مطابق محاسبات میزان گروههاي تیول حفاظت شده حاصل شد .
میزان گروههاي تیول حفاظت شده براي هر یک از غلظتهاي پنج گانه فرکشنهاي آنتی اکسیدانی بطور مجزا آزمایش و اندازه گیري شد در خاتمه میزان درصد حفاظت از گروههاي تیول براي هر غلظت فرکشنی در مقایسه با شاهد محاسبه گردید .
نتایج :
الف - تعیین ظرفیت آنتی اکسیدانی خرچنگ آبی : پس از انجام کروماتوگرافی ، فرکشنهاي حاصل از هر مرحله (ژل فیلتراسیون – تویض یونی) از نظر میزان توتال پروتئین و توتال آنتی اکسیدانی مورد بررسی قرار گرفت (جداول شماره 1ؤ .(2
جدول شماره : 1 نتایج سنجش توتال پروتئینی و توتال آنتی اکسیدان حاصل از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون خرچنگ آبی
جدول شماره : 2 نتایج سنجش پروتئین و توتال آنتی اکسیدان فراکسیونهاي گروه A حاصل از کروماتوگرافی تعویض یونی
ب – اثر بخشی فرکنشهاي آنتی اکسیدانی خرچنگ آبی در مهار همولیز گلبولهاي قرمز :
از فرکنشهاي گروه AI که بیشترین میزان توتال آنتی اکسیدان را داشتند ضمن رقیق سازي ، فرکسیونهایی با میزان توتال آنتی اکسیدان 12) ، 9 ، 6 و 3 و (1/2 میلی مول در لیتر که معادل با غلظتهاي 100) ، 75 ، 50 ، 25 و (10 درصد بود تهیه شد ، سپس هر فرکسیون در مجاورت گلبول قرمز قرار گرفت ، پس از افزودن میزان مشخصی AAPH براي مدت 2
ساعت انکوباسیون در دماي 37 درجه انجام شد سپس میزان همولیز ایجاد شده براي تمامی لوله ها و نیز لوله ي شاهد (فاقد فرکسیون آنتی اکسیدانی) به روش اسپکتروفتومتري در طول موج 415 نانومتر قرائت گردید و درصد مهار همولیز محاسبه گردید (نسبت به نمونه شاهد) ، کلیه اعداد به دست آمده در p <0/05 معنی دار تلقی گردید (جدول شماره (3
جدول شماره : 3 میزان اثر بخشی فرکسیونهاي آنتی اکسیدانی خرچنگ آبی در مهار همولیز گلبولهاي قرمز
