بخشی از مقاله
چکیده:
در این مطالعه تاثیر وزن مولکولی پپتیدها و فعالیت آنتیاکسیدانی ژلاتین هیدرولیز پوست فیل ماهی پرورشی مورد بررسی قرار گرفت. از آنزیم آلکالاز در غلظتهای 1 تا 5 درصد جهت هیدرولیز ژلاتین استفاده گردید و فعالیت آنتیاکسیدانی از طریق حذف رادیکالهای 2،-2 آزینوبیوس- - -3اتیل بنزوتیازیلون--6سولفونیک اسید - - ABTS - ، 2،-2دی فنیل--1پیکریل هیدرازیل - DPPH - ، رادیکالهای هیدروکسیل - OH.- - و قدرت کاهندگی فریک - FRAP - اندازه گیری شد.
نتایج نشان داد که پپتیدها در ژلاتین هیدرولیز بخصوص در غلظت 5 درصد آنزیم، اغلب از پپتیدهای کوچک زنجیره با وزن مولکولی کمتر از 500 دالتون تشکیل یافتند. فعالیت آنتی اکسیدانی ژلاتین هیدرولیز تحت تاثیر غلظت آنزیم قرار گرفت بطوریکه با افزایش غلظت آنزیم فعالیت حذف کنندگی رادیکالها افزایش نشان داد.
همچنین ژلاتین هیدرولیز تولید شده با 5 درصد آنزیم بخصوص در غلظت 20 میلی گرم در میلی لیتر دارای قدرت کاهندگی فریک بالایی در مقایسه با سایر نمونهها بوده است. نتایج نشان داد که پوست فیل ماهی پرورشی که طی فرآوری بصورت ضایعات تولید میشود میتواند برای تولید پپتیدهای آنتی اکسیدانی استفاده گردد که میتوانند بطور بالقوه بعنوان ترکیبات زیست فعال در کنترل اکسیداسیون و همچنین تولید فرآوردههای فراسودمند مورد استفاده قرار گیرند.
مقدمه
گونههای واکنشگر اکسیژن - ROS - طی واکنشهای نرمال متابولیکی در بدن تولید می شوند. تعادل بین سیستم آنتی اکسیدانی بدن و رادیکالهای آزاد جهت حفظ عملکرد فیزیولوژیک نرمال بدن ضروریست در غیر اینصورت با بروز استرس اکسیداتیو، اجزاء سلولی مانند DNA در معرض آسیب قرار میگیرند. زمانیکه اجزاء سلولی برای مدت طولانی در معرض آسیب اکسیداتیو قرار گیرند، بیماریهای مزمن بروز می کنند.
در این رابطه رادیکال های هیدروکسیل مهمترین رادیکال واکنش گر اکسیژنی می باشد که بلافاصله پس از تشکیل با اجزاء سلولی مانند پروتئین، DNA، فسفولیپید، اسیدهای آمینه و قند واکنش میدهد . - Shahidi and Zhong, 2015 - رادیکال های آزاد نه تنها در سیستمهای بیولوژیک دارای اهمیت میباشند بلکه همچنین در صنعت غذایی مورد توجه میباشند چون کیفیت مواد غذایی تحت اثر اکسیداسون چربی تحت القاء رادیکالها در زمان فرآوری و نگهداری بسرعت کاهش مییابد.
در سیستمهای مواد غذایی، اکسیداسیون اجزاء تشکیل دهنده یکی از مهمترین مشکلات صنعت فرآوردههای غذایی و دریایی محسوب میگردد. اکسیداسیون چربی خصوصا در آبزیان که منبع سرشار اسیدهای چرب چند غیر اشباع میباشند سبب ایجاد بو و طعم نامطلوب، تغییر در رنگ و بافت محصول، تولید ترکیبات سمی مانند مالون دی آلدهید و ترکیبات ناشی از اکسیداسیون کلسترول میگردد و از سویی دیگر خصوصیات عملکردی پروتئین نیز با افت شدید مواجه می گردد .
ترکیبات ضد اکساینده سبب به تاخیر افتادن، کنترل و یا توقف اکسیداسیون چربی در مواد غذایی میگردند. ضد اکساینده های سنتزی جهت مهار رادیکالهای آزاد و کنترل اکسیداسیون مورد استفاده قرار میگیرند. بدلیل اثرات احتمالی سمیت و سرطان زایی ترکیبات سنتزی، مطالعات در سال های اخیر به سمت ترکیبات ضد اکساینده طبیعی معطوف شده است
مطالعات مختلف نشان داده که طی هیدرولیز پروتئین های مواد غذایی، پپتید های زیست فعال که معمولا از2 تا 20 اسید آمینه تشکیل شده اند و وزن مولکولی بین 200 تا 1800 دالتون دارند آزاد می شوند که دارای خاصیت آنتی اکسیدانی بوده و از آبزیان مختلف استخراج گردیدند . - Wang et al ., 2013 - از اینرو، پپتید های تولید شده از منابع دریایی با خاصیت آنتی اکسیدانی می تواند به عنوان جایگزین سالم آنتی اکسیدانهای سنتزی در کنترل اکسیداسیون در فراورده های دریایی باشد . - Harnedy and FitzGerald, 2012 - هدف این مطالعه تولید ژلاتین هیدرولیز از پوست فیل ماهی پرورشی به عنوان ضایعات فرآوری و بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی پپتد های حاصل بوده است.
مواد و روشها
برای استخراج ژلاتین، پس از حذف رنگدانهها و پروتئین های غیر کلاژنی توسط هیدروکسید سدیم 1 مول - 6 ساعت - و چربی توسط الکل ان-بوتانول 10 درصد 18 - ساعت - ، متورم سازی پوست توسط اسید استیک 0/05 مول بمدت 3 ساعت انجام وسپس ژلاتین در دمای 50 درجه سانتی گراد برای مدت 6 ساعت استخراج شد. هیدرولیز ژلاتین با استفاده از آنزیم آلکالاز در غلظتهای 1 تا 5 درصد برای مدت 180 دقیقه انجام گردید.
محلول پپتبدی ابتدا سانتریفیوژ 10000 - دور در دقیقه، 10 دقیقه - و سپس توسط فریز درایر خشک گردید. مقدار پروتئین ژلاتین هیدرولیز به روش بیورت و با استفاده از آلبومین سرم گاوی به عنوان استاندارد تعیین شد . - Gornall et al., 1949 - درجه هیدرولیز از طریق رابطه: DH - % - = BNb / × Ktot × Mp که در این معادله B حجم باز مصرفی بر حسب میلی لیتر، Nb نرمالیته باز، Mp وزن پروتئین بر حسب گرم، htot مقدار کل پپتید های موجود برای هیدرولیز و از طریق معادله مربوطه 0/87 - زمان استفاده از آلکالاز - تعیین گردید
. - Adler-Nissen, 1986 - وزن مولکولی پپتیدها با استفاده از HPLC و توسط ستون TSKgel 2500 PWXL با قطر داخلی 7,8 میلی متر و طول 300 میلی متر اندازهگیری شد. تعیین فعالیت آنتیاکسیدانی با اندازهگیری فعالیت حذف کنندگی رادیکال - 2,2-diphenyl-1-picrylhdrazyl - DPPH، - 2,2'-azinobios- - 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid - - ABTS، هیدروکسیل - .OH - و قدرت کاهندگی فریک - FRAP - تعیین شد - Wang et al., .2013; Nikoo et al., 2014 - آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار SPSS شماره 16 و آنالیز واریانس یکطرفه - ANOVA - و آزمون مقایسه میانگین چند دامنه ای دانکن در سطح اطمینان 95 درصد - P < 0.05 - انجام گرفت.
نتایج و بحث
هیدرولیز آنزیمی با استفاده از آنزیمهای پروتئولیزی بطورگسترده جهت تبدیل پروتئین خصوصا پروتئین های بدست آمده از ضایعات فرآوری آبزیان به پپتیدهای زیست فعال استفاده شده اند. هیدرولیز آنزیمی سبب شکسته شدن پروتئین به پپتیدهای با خواص عملکردی مختلف می گردد این امر منجر به ارتقاء ویژگی های فراسودمندی وتغذیه ای پروتئین می گردد.
درجه هیدرولیز تحت تاثیر غلظت آنزیم و زمان هیدرولیز قرار گرفت. با افزایش غلظت آنزیم، شکستگی پیوند های پپتیدی به میزان بالاتری اتفاق افتاد و از طرفی حداکثر هیدرولیز طی مدت 30 دقیقه اول اتفاق افتاد - شکل . - 1 پپتید ها در ژلاتین هیدرولیز بخصوص در غلظت 5 درصد آنزیم، اغلب از دی- پپتید ها و تیری- پپتید ها با وزن مولکولی کمتر از 500 دالتون - بیشتر از 50 درصد - تشکیل یافتند
فعالیت آنتی اکسیدانی پپتید ها در ژلاتین هیدرولیز تحت تاثیر غلظت آنزیم قرار گرفت بطوریکه با افزایش غلظت آنزیم فعالیت حذف کنندگی رادیکال ها افزایش نشان داد. در رابطه با رادیکال ABTS، در غلظت های 10 و 20 میلی گرم در میلی لیتر تفاوتی مهار رادیکال ها بین غلظت های مختلف آنزیم وجود نداشت. ژلاتین هیدرولیز تولید شده با 5 درصد آنزیم بخصوص در غلظت 10 و 20 میلی گرم در میلی لیتر بالاترین قدرت کاهندگی فریک در مقایسه با سایر نمونه ها را نشان دادند
شکل - 1 نمودار درجه هیدرولیز - درصد - ژلاتین با استفاده از آنزیم آلکالاز در سطوح مختلف برای مدت 180 دقیقه
شکل -2 کروماتوگرام وزن مولکولی - دالتون - پپتید های ژلاتین هیدرولیز تولید شده با غلظت آنزیم 5 درصد پس از 180 دقیقه
شکل -3 فعالیت حذف کنندگی رادیکالهای DPPH، ABTS، هیدروکسیل و قدرت کاهندگی فریک - FRAP - ژلاتین هیدرولیز تولید شده با استفاده از آنزیم آلکالاز در سطوح مختلف
