بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از این تحقیق تولید پپتیدهاي بیواکتیو از پروتئین هاي سفیده تخم مرغ با استفاده از آنزیم فیسین و تریپسین و جداسازي آن ها و تعیین خاصیت آنتی اکسیدانی آنها است.
مواد و روش ها: پروتئین هاي سفیده تخم مرغ به کمک تریپسین 0/1 - میلی گرم در میلی لیتر - و فیسین 8 - میلی گرم در میلی لیتر - هیدرولیز شده و قطعات پپتیدي حاصل از هضم آنزیمی پروتئین هاي سفیده تخم مرغ پس از خشک شدن به روش انجمادي، با روش کروماتوگرافی تبادل یونی تفکیک گردیدند، سپس خواص زیست فعالی نمونه هاي حاصل از کروماتوگرافی بررسی شدند.
نتایج و بحث: در بین فرکسیون هاي جداشده، فرکسیون 8 بدست آمده از هیدرولیز پروتئین هاي سفیده تخم مرغ با آنزیم تریپسین و جداشده با کروماتوگرافی تبادل یونی و فرکسیون 9 بدست آمده از هیدرولیز پروتئین هاي سفیده تخم مرغ با آنزیم فیسین 8 - میلی گرم در میلی لیتر - و جداشده با کروماتوگرافی تبادل یونی بیشترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان می دهند. نتایج این پژوهش نشان داد که پروتئازها توانایی تولید پپتیدهایی از پروتئین هاي سفیده تخم مرغ را دارا می باشند.
نتیجه گیري کلی: خالص سازي چنین پپتیدهایی راه را براي جایگزین سازي آن ها بجاي داروهاي ضدفشار خون، ضدمیکروبی و آنتی اکسیدانی، با منشا شیمیایی هموار می سازد.
-1 مقدمه:
خاصیت آنتی اکسیدانی یک خاصیت مهم در سلامتی انسان می باشد که میتواند از بدن انسان در برابر حملات گونه هاي اکسیژن غیرفعال - Reactive Oxygen Species - به ماکرومولکول هایی مانند لیپیدهاي غشایی، پروتئین ها و DNA که منجر به سرطان، دیابت و بیماري هاي عصبی می شود، محافظت کند - - Ngo et al 2011 همچنین اکسیداسیون ها یکی از دلایل اصلی فساد مواد غذایی می باشند et al 2012 - . - Bernardini مطالعات جدید نشان میدهد که پپتیدهاي آنتی اکسیداتیو میتوانند توسط آنزیمهاي هضم کننده و تخمیري شیر به وسیله سویههاي پروتئولیتیک باکتریهاي مولد اسید لاکتیک از کازئین هیدرولیز شده آزاد شوند. به طور مثال، در طی تخمیر توسط لاکتو باسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس، یک پپتید آنتی اکسیداتیو از کاپا کازئین تشکیل میشود.
بیشتر پپتیدهاي شناخته شده از آلفا اس کازئین داراي فعالیت به داماندازي رادیکالهاي آزاد میباشند که پراکسیداسیون آنزیمی و غیر آنزیمی، چربی ها را مهار میکنند. در آینده ممکن است پپتیدهاي آنتی اکسیداتیو بعنوان ماده مؤثردر موارد مختلف مثلاً در پیشگیري از اکسیداسیون مواد غذایی حاوي چربی، مواد آرایشی و دارویی استفاده شود. اما هنوز مطالعات بیشتري براي نشان دادن فواید سلامت زایی پپتیدهاي آنتی اکسیداتیو متشکله در طی تخمیر شیر نیاز است . - Korhonen et al, 2006 - اووآلبومین، اوترانسفرین، اوموکوئید و لیزوزیم فراوان ترین پروتئین سفیده هستند که بالغ بر 90 درصد محتواي پروتئینی آن را به خود اختصاص میدهند.
اووآلبومین بیش از نیمی - %54 - از محتواي پروتئینی سفیده را تشکیل می دهد و مسئول بخش عمده ي ویژگی هاي عمومی سفیده است. وزن این پروتئین تک واحدي 44/5 کیلودالتون و نقطه ایزوالکتریک آن 4/5 است. اووآلبومین یک پروتئین مرجع محسوب می شود، همچنین در زمینه ي بیوشیمی بعنوان پروتئین حامل، نگهدارنده، عامل مسدودکننده یا استاندارد، موارد استفاده متعدد دارد. اوترانسفرین حدود %13 پروتئین هاي سفیده را تشکیل می دهد، وزن این پروتئین 77/7 کیلو دالتون و نقطه ایزوالکتریک آن 6/1 است. اوترانسفرین بعنوان یک افزودنی غذایی در محصولات غنی شده یا آهن قابل استفاده است.به علاوه نشان داده اندکه این پروتئین حتی بدون حضور آهن در ساختمان خود نیزخاصیت میکروب کشی دارد.
اوموکوئید که 11 درصدپروتئین هاي سفیده را تشکیل می دهد، با اسپکتروسکوپی جرمی وزنی معادل 28 کیلودالتون و نقطه ایزوالکتریک آن 4/1 است. در روش SDS-PAGE وزن مولکولی این پروتئین در محدوده 30-43 کیلودالتون دیده می شود. وزن بالا و متنوع اوموکوئید در روش SDS- PAGE ناشی از اتصال کم SDS به این پروتئین به دلیل محتواي بالاي کربوهیدرات آن است. بارزترین خصوصیت این پروتئین، قابلیت مهار تریپسین است.
طبق گزارش، اوموکوئید مهم ترین آلرژن سفیده محسوب می شود. لیزوزیم باوزن مولکولی 14/1 کیلودالتون و نقطه ایزولکتریک معادل 10/7 است. لیزوزیم حدود % 3/5 پروتئین هاي سفیده را تشکیل می دهد. این پروتئین که یک عامل ضدباکتریایی است، می تواند استفاده هاي متنوعی در علوم زیستی یا در غذا به عنوان یک افزودنی بی ضررداشته باشد - ویسی و همکاران، . - 1387 پروتئین هاي سفیده منابعی سرشار از پپتیدهاي بیواکتیو هستند.
-2 مواد و روش ها:
-1 -2 مواد مورد نیاز:
تخم مرغ تازه از مرغ نژاد لگهورن، تهیه شده از مرغداري دانشکده دامپزشکی، تریپسین تهیه شده از شرکت سیگما1 آمریکا ، با میزان فعالیت10000 < units / mg protein٢ BAEE ، فیسین تهیه شده از شرکت سیگما آمریکا، با میزان فعالیت 1 units / mg protein <، -1 دي فنیل -2 پیکریل هیدرازیل تهیه شده از شرکت سیگما با وزن مولکولی 394/32 گرم بر مول، رزین CM -25 ساخت شرکت سیگما
-2-2 آماده سازي نمونه:
-1- 2-2 تهیه نمونه هیدرولیز شده سفیده تخم مرغ با آنزیم فیسین: 4 میلی لیتر سفیده تخم مرغ با 16 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 0/1 مولار ،pH 7/6، مخلوط شد. 2 میلی لیتر محلول 0/25 مولار - - L سیتئین ،pH 7، و 2 میلی لیتر محلول اتیلن دي آمین تترا استیک اسید 0/25 مولار و 2 میلی لیتر محلول 0/25 مولار هیدروکسید سدیم و 6 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 1 مولار ،pH 7 و 4 میلی لیتر آب مقطر اضافه شد، محلول را در حمام 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت و بلافاصله محلول آنزیم فیسین 8 - میلی گرم آنزیم فیسین با فعالیت بیشتر از 1 units / mg protein ، در 2 میلی لیتر بافر فسفات سدیم 1 مولار،pH 7، حل شد - اضافه شد و انکوبه کردن محلول به مدت 60 دقیقه در دماي 37 ° ادامه یافت. مایع فوقانی در دماي - 18 ° گذاشته و سپس توسط دستگاه خشک کن انجمادي به پودر تبدیل شد . - Liener. et al, 1970 -
-2 -2-2تهیه نمونه هیدرولیز شده سفیده تخم مرغ با آنزیم تریپسین: 5 میلی لیتر سفیده تخم مرغ با 20 میلی لیتر آب مقطر مخلوط گردید. 8 میلی لیتر بافر بورات سدیم 0/1 مولار ،pH 8، به مخلوط افزوده گردید سپس محلول را در حمام آب 37 گذاشته و بلافاصله محلول آنزیم تریپسین 0/1 - میلی گرم آنزیم تریپسین با فعالیت بیشتر از °10000 BAEE units / mg protein ، در 1 میلی لیتر بافر بورات سدیم 0/1 مولار حل شد - اضافه شد و محلول را به مدت 30 دقیقه در دماي 37 ° نگهداري شد. سپس محلول در -18° گذاشته و توسط خشک کن انجمادي به پودر تبدیل شد . - Liu et al, 2010 -
-3 -2 جدا سازي پپتیدهاي بیواکتیو::
نمونه هاي سفیده تخم مرغ در معرض کروماتوگرافی تبادل یونی قرار داده شدند. 100 میلی گرم نمونه سفیده تخم مرغ در 2 میلی لیتر بافر استات سدیم 0/02 مولار، pH 4/5، حل گردید. پس از سانتریفیوژ شدن، به ستون 5 × 18 cm ، پر شده با رزین هاي سفادکس Cm- 25 تزریق گردید. براي گروماتوگرافی تبادل یونی از شیب نمکی کلرید سدیم 0 -1/ 0 در بافر استات سدیم 0/02 مولار استفاده گردید. جذب نمونه هاي جمع آوري شده در 220 نانومتر خوانده شد و سپس لیوفیلیزه شدند - JingBo et al, 2010 -
-4-2 اندازه گیري فعالیت آنتی اکسیدانی:
براي تعیین فعالت آنتی اکسیدانی از آزمون 3DPPH استفاده شد. این روش مربوط به توانایی آنتی اکسیدان در انتقال اتم هیدروژن یا الکترون، به یک ترکیب رادیکالی مصنوعی پایدار می باشد که تحت عنوان روش هاي حذف رادیکال بیان می گردد.
