مقاله تأثیر آنزیم آلکالاز بر خواص ضداکسایش ، عملکردی و حسی پپتیدهای حاصل از هیدرولیز پروتئین کنجاله دانه کدو

بخشی از مقاله

چکیده

در این تحقیق پروتئین کنجاله دانه کدو توسط آنزیم آلکالاز %2-1 - غلظت آنزیم، زمان 2-5 ساعت و دمای 45-55 درجه سانتیگراد - هیدرولیز شده و تأثیر فرایند هیدرولیز بر خواص ضداکسایش، عملکردی و حسی هیدرولیز شده نهایی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج از میان 20 نمونه تولید شده، نمونه تهیه شده با %2 آنزیم آلکالاز در دمای 50 درجه سانتیگراد و زمان 3/5 ساعت به عنوان نمونه بهینه از نظر قدرت مهار رادیکال %90/14 - DPPH و IC50= 0.99 میلی گرم بر میلی لیتر - انتخاب گردید. از نظر ترکیب شیمیائی کنجاله و ایزوله دانه کدو دارای پروتئین بالائی بودند در حالیکه نمونه هیدرولیز شده دارای پروتئین بیشتری در مقایسه با ایزوله و کنجاله دانه کدو بود. چربی موجود در پروتئین هیدرولیز شده از چربی ایزوله، و چربی ایزوله از چربی موجود در کنجاله دانه کدو کمتر بود و در مورد میزان خاکستر، نمونه هیدرولیز شده دارای خاکستر بیشتر از ایزوله دانه کدو بود. عمل هیدرولیز منجر به افزایش معنیدار در قدرت امولسیون کنندگی و کف کنندگی نمونه هیدرولیز شده در مقایسه با نمونه پروتئین دست نخورده گردید. از لحاظ ویژگیهای حسی طعم تلخ توسط داوران به عنوان طعم غالب در نمونه پروتئین هیدرولیز شده تشخیص داده شد. با توجه به نتایج بدست آمده میتوان پروتئینهای هیدرولیز شده را به عنوان ترکیبات ضد اکسایش طبیعی با قدرت امولسیون کنندگی و کف کنندگی مناسب در نظر گرفت.

کلمات کلیدی: آلکالاز، خواص عملکردی، ضداکسایش، کنجاله دانه کدو

.1 مقدمه

در حال حاضر تیمارهای آنزیمی متداولترین راه برای اصلاح کردن پروتئینها هستند. ارزش تغذیهای و خواص عملکردی هیدرولیز شدههای نهایی بستگی به وزن مولکولی و ویژگیهای ساختمانی داشته و انجام عملیات هیدرولیز آنزیمی تحت شرایط کنترل شده امکان تبدیل پروتئینها به پپتیدهایی با ویژگیهای مطلوب را فراهم خواهد آورد . - 24 -

پپتیدهای زیست فعال به عنوان اجزاء پروتئینی شناخته میشوند که در ساختمان پروتئین غیرفعال بوده و پس از آزاد شدن از طریق هیدرولیز، تخمیر، هضم شدن توسط آنزیمهای گوارشی و غیره اثرات متعددی بروز میدهند . - 10 - پپتیدهای زیست فعال حاوی 3-20 اسید آمینه و وزن مولکولی کمتر از 6000 دالتون هستند که اثرات مثبتی بر سلامت مصرف کننده دارند . - 16 - امروزه پپتیدهای زیست فعال به علت قابلیت استفاده در تهیه مواد غذایی فراسودمند مورد علاقه و توجه هستند . - 21 -

نشان داده شده است که پپتیدهای زیست فعال تولید شده در جریان هیدرولیز پروتئینها دارای اثرات ضداکسایش هستند. به عنوان مثال جامدار و همکاران - 10 - با بررسی اثر درجهی هیدرولیز بر ویژگیهای عملکردی و فعالیت ضداکسایش پروتئین هیدرولیز شدهی بادام دریافتند که با افزایش درجهی هیدرولیز پروتئینها - از 10 تا 40 درصد - توسط آنزیم آلکالاز فعالیت شلاته کنندگی یون آهن1III و زدودن رادیکالهای DPPH افزایش مییابد، درحالیکه قدرت احیا کنندگی روند کاهشی ازخود نشان داد.

هیدرولیز آنزیمی تاکنون به شکل گستردهای برای بهبود ویژگیهای عملکردی پروتئینها مانند امولسیونکنندگی و کفکنندگی، جذب آب و روغن، ژلکنندگی و ... مورد استفاده قرار گرفته است. گزارش شده است که پروتئینهای هیدرولیز شده دارای کف-گنندگی و امولسیون کنندگی مناسبی هستند، بنابراین ممکن است به عنوان ترکیبات امولسیونکننده و پایدار کننده امولسیون در محدوده وسیعی از مواد غذایی و نیز کمک به ایجاد کف در محصولات مختلف مورد استفاده قرار گیرند. خواص عملکردی هیدرولیز شدههای ماهی گیش خط زرد - Selaroides leptolepis - تولید شده با آلکالاز و فلیورزایم توسط کلمپنگ و همکاران - 14 - بررسی شد. بر طبق گزارشات هیدرولیز با هر دو آنزیم منجر به افزایش حلالیت پروتئین به بیش از %85 گردید. در حالیکه با افزایش هیدرولیز ویژگیهای بین سطحی هیدرولیز شدههای حاصل - امولسیونکنندگی و پایداری امولسیون، کفکنندگی و پایداری کف - کاهش یافت که احتمالا به دلیل کاهش در اندازه زنجیره پپتیدی بوده است.

کدو یکی از سبزیجات دولپهای با ساقهای انعطافپذیر و رشد سالانه 0/6 متر تا 5 متر - در حالت رشد سریع - است. تاکنون استفاده عمده از دانههای کدو به منظور روغنکشی بوده است. پس از این فرایند یک محصول جانبی سرشار از پروتئین - %60-65 - به نام کنجاله دانه کدو باقی خواهد ماند. حجم بالای فرآوردههای جانبی منجر به ایجاد منابع عظیمی میشود که دفع آن نیازمند صرف زمان و هزینههای فراوان است. تاکنون مصرف اصلی این کنجاله برای مصارف خوراک دام بوده است. یکی از راههای ارزش افزائی به این محصول جانبی که دارای ارزش اقتصادی بالایی میباشد هیدرولیز آنزیمی این ترکیب است . - 24 - هدف از این پژوهش هیدرولیز آنزیمی پروتئین کنجاله کدو توسط آلکالاز و بررسی ویژگیهای ضداکسایش، عملکردی و حسی پپتیدهای زیست فعال تولیدی می-باشد.

.2 مواد و روشها
کنجاله دانه کدو - Cucurbita pepo con. Pepo var. Styriaca - از شرکت سویابین گرگان، آنزیم آلکالاز، رادیکال DPPH، سدیم دودسیل سولفات1، کافئین2، از شرکت سیگما و سود، هگزان، اسید کلریدریک، اتانول و بافرهای مورد استفاده از شرکت مرک تهیه شدند. تمام مواد مورد استفاده از خلوص آزمایشگاهی برخوردار بودند.

.1,2 مراحل انجام پژوهش
.1,1,2 روغن گیری از کنجاله دانه کدو

پس از حذف مواد خارجی، کنجاله توسط دستگاه آسیاب به آرد تبدیل شد. آرد حاصل به مدت 16ساعت با حلال هگزان به نسبت 1:3 چربیگیری، و پس از نگهداری به مدت 48 ساعت در دمای محیط، به یخچال منتقل شد . - 12 -

.2,1,2 تهیه ایزوله پروتئینی از کنجاله دانه کدو

کنجاله چربیگیری شده دانه کدو به نسبت 1:10 در آب پراکنده شد. سپس pH محلول توسط سود 1 نرمال به 10 رسیده و به مدت یک ساعت در دمای اتاق مخلوط شد. مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه با دور 5000 g و دمای 4 درجه سانتیگراد در سانتریفوژ یخچال دار قرار گرفت. به منظور رسوب پروتئینهای دانه کدو، pH مایع روئی توسط اسید کلریدریک 1 نرمال به 5 رسیده و تحت شرایط مشابه سانتریفوژ شد. رسوب بدست آمده - ایزوله پروتئینی - مستقیما برای هیدرولیز مورد استفاده قرار گرفت . - 24 -

.3,1,2 هیدرولیز ایزوله پروتئینی حاصل از کنجاله دانه کدو

به این منظور ایزوله پروتئینی به نسبت %5 - وزنی/حجمی - در بافر تریس-اسیدکلریدریک با pH برابر با 9 پراکنده و آنزیم در غلظت %1 تا %1 - %2، %1/5 و - %2 افزوده شد. سپس هیدرولیز در محدوده دمائی 45 - 45-55، 50 و - 55 درجه سانتیگراد و به مدت 2-5 2 - ، 3/5 و - 5 ساعت در انکوباتور شیکردار با دور 200 دور بر دقیقه به انجام رسید. در انتها واکنش آنزیمی در 85 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه متوقف و سانتریفوژ کردن برای حذف ترکیبات اضافه در 5000 g به مدت 30 دقیقه انجام گرفت . - 22 - هیدرولیز شده پروتئینی با استفاده از خشک کن انجمادی خشک گردید.
.2,2 خصوصیات شیمیائی کنجاله دانه کدو
اندازه گیری رطوبت توسط روش - 3 - 44 - 15 AACC، اندازه گیری خاکستر کنجاله با استفاده از روش - 3 - 08- 01 AACC، تعیین پروتئین کنجاله با استفاده از روش - 3 - 46-12 AACC و چربی با استفاده از روش سوکسله - 1 - انجام گرفت.

.3,2 قدرت مهار رادیکال DPPH
1000 میکرولیتر از پروتئین هیدرولیز شده با 1000 میکرولیتر محلول 0/1 - DPPH میلی مولار - تهیه شده در اتانول %96 مخلوط شد، مخلوط حاصل به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری و در نهایت جذب محلول در طول موج 517 نانومتر اندازه-گیری شد . - 3 - در نمونه کنترل به جای پروتئین هیدرولیز شده از1000 میکرولیتر آب مقطر استفاده شد. فعالیت مهارکنندگی رادیکال از رابطه زیر محاسبه گردید:

بهینه سازی فرایند بر اساس قدرت مهار رادیکال DPPH توسط نرم افزار RSM انجام شده و بهترین نمونه برای انجام مراحل بعدی انخاب گردید . - 2 -

.4,2 بررسی قدرت امولسیون کنندگی

10 سی سی روغن گیاهی با 30 سی سی محلول پروتئین %0/1 مخلوط شده و به 4 pH، 6، 8 و 10 رسانده شد. سپس مخلوط به مدت 1 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه هموژن شد. 50 میکرولیتر از امولسیون تولید شده از ته ظرف با 5 سی سی محلول سدیم دودسیل سولفات %0/1 مخلوط شده و جذب بلافاصله و 10 دقیقه پس از تشکیل امولسیون در 500 نانومتر اندازهگیری شد. قدرت امولسیونکنندگی از طریق رابطه زیر محاسبه شد : - 4 -

× 2/303 × 2 جذب در دقیقه صفر  =  فعالیت امولسیون کنندگی - m2/g -
وزن پروتئین - گرم - F ×

:F حجم جزء روغن - 0/25 -

.5,2 قدرت کف کنندگی

20 سی سی محلول پروتئین % 0/5 به 4 pH، 6 ، 8 و 10 رسانده شده و به مدت 3 دقیقه با سرعت 10000 دور بر دقیقه هموژن گردید. نمونه زده شده بلافاصله به استوانه مدرج 100 سی سی منتقل شده و حجم کل پس از 30 ثانیه و 60 دقیقه در دمای اتاق اندازهگیری شده و ظرفیت کفکنندگی از رابطه زیر محاسبه شد : - 4 -
-     = - ظرفیت کف کنندگی - % -

:A0 حجم نمونه پس از زده شدن :B حجم نمونه قبل از زده شدن

.6,2 آنالیز حسی

بررسی شدت مزه ترشی، تلخی و شوری نمونه هیدرولیز شده با استفاده از روش آنالیز حسی توسط 15 داور آموزش دیده انجام گرفت. نمونه شامل 10 سی سی هیدرولیز شده مایع بود که در ظروف خاصی قرار داده شده بود. برای شدت مزه تلخی، ترشی و شوری یک جدول 5 واحدی که در یک سمت آن 0 - هیچ - و در سمت دیگر 5 - خیلی - قرار گرفته بود تهیه شد. از لاکتیک اسید 10 میلیمولار به