بخشی از مقاله
چکیده
دراین مطالعه براي بدست آوردن پپتید هاي فعال زیستی باخصوصیت آنتی اکسیدان پروتئین هاي سفیده ي تخم شترمرغ توسط آنزیم گوارشی پپسین هیدرولیز شد.فعالیت آنتی اکسیدانی هیدرولیزات توسط دو روش حذف رادیکال آزاد DPPH و اثر شلاتی شدن یون هاي فلزي آهن مورد بررسی قرار گرفتند. براي این کار ابتدا پپیتد ها توسط سیستم اولترافیلتراسیون با غشاء 1,000 Da عبورداده شدند و سپس با روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - - HPLC خالص سازي شدند.
در این مطالعه 3 فرکشن با شماره هاي 1،7و2 اثرات بهتري حذف رادیکالی آنتی اکسیدانی نسبت به دیگر فرکشن ها داشتند که مقادیر آنها به ترتیب 31،34و29 درصد نسبت به کنترل بدست آمد. براي سنجش فعالیت شلاتی شدن یون هاي آهن نیز 3 فرکشن 17، 8 و 18 به ترتیب داراي درصد هاي 15،15و10 بودند. نتایج نشان می دهد که هضم پروتئین هاي سفیده ي تخم شترمرغ توسط آنزیم گوارشی پپسین پپتید هاي فعال زیستی را بوجود می آورد که می توانند اثرات آنتی اکسیدانی خوبی را به نمایش بگذارند.
.1مقدمه
در سال هاي اخیر تحقیقات زیادي برروي پپتیدهاي فعال زیستی صورت گرفته است. پپتید هایی که اغلب 20-2 اسید آمینه طول دارند و تا زمانی که در ساختار پروتئین قرار دارند به صورت غیرفعال می باشند زمانی فعال می شوند که تحت اثر آنزیم هاي هضم کننده ي گوارشی،آنزیم هاي تجاري و یا فعالیت میکروبی قرار گیرند. این پپتید ها از منابع متعددي از جمله لبنیات، تخم، سویا، گوشت و شیر قابل جداسازي هستند.
تا کنون اثرات آنتی اکسیدانی، آنتی میکروبی، آنتی ترومبوتیک، آنتی کلسترولی، ضد افسرده گی و همچنین فعالیت آنها بر روي مهار آنزیم تبدیل کننده ي آنژیوتانسین به اثبات رسیده است و نیز تعدادي از این پپتید ها اثرات چندگانه را بروز داده اند.[2] فعالیت آنتی اکسیدانی پپتید هاي فعال یکی از موضوعات بسیار مهم می باشد که مطالعات زیادي برروي آنها انجام شده است.
مواد آنتی اکسیدان معمولا به عنوان یک جزء ترکیبی براي تامین سلامتی انسان و همچنین بالا بردن نیمه عمر مواد غذایی در فرمول هاي غذایی استفاده می شوند و تا کنون آنتی اکسیدانت هایی که به مواد غذایی افزوده می شد به صورت مصنوعی ساخته می شدند که علاوه بر داشتن مزایا اثار مخربی را به سلامتی انسان وارد می کردند.از این رو تحقیقات به سمت تولید آنتی اکسیدان هاي طبیعی صورت گرفت تا به عنوان جایگزین خوب براي آنتی اکسیدان هاي سنتزي در مواد غذایی استفاده شوند و در این صورت فقط اثرات مفید خود را به انسان وارد کنند
در این مقاله مطالعه برروي حذف رادیکالهاي آزاد و اثر شلاتی شدن یون هاي آهن توسط پپتید هاي فعال زیستی صورت گرفته است. و براي تحقق این هدف از پپتیدهاي استخراج شده از پروتئین هاي سفیده ي تخم شترمرغ تحت اثر آنزیم گوارشی پپسین استفاده شد وپس از جداسازي پپتید ها به روش HPLC، به شناسایی پپتیدهاي با خاصیت آنتی آکسیدانی پرداخته شد، کاري که تا کنون هیچ گزارشی در مورد اثرات این پپتید ها از این منبع غذایی صورت نگرفته است.
.2 مواد و روش ها
.2.1 مواد
سفیده ي تازه ي تخم شترمرغ از بازار محلی خریداري شد، پروتئین سرم آلبومین گاوي،معرف کوماسی بلوG250،پروتئاز پپسین،فیروزین،DPPH ودي کلریدآهن از شرکت سیگما خریداري شد.
.2.2 تعیین غلظت پروتئین
براي تعیین غلظت پروتئین سفیده تخم شتر مرغ از روش تعیین غلظت پروتئین برادفورد - 1976 - با استفاده از سرم آلبومین گاوي به عنوان پروتئین استاندارد استفاده شد.
.2.3 آماده سازي پروتئین هیدرولیز شده و تعیین زمان بهینه ي هیدرولیز
پس از جداسازي سفیده از زرده یک تخم، آن را 4 برابر وزن آن، بوسیله بافر گلایسین- 50 HCl میلی مولار - - pH 2 رقیق شد. براي تعیین زمان بهینه هضم هیدرولیزات، بر اساس روش Mouming Zhao و همکارانش - 2009 - هیدرولیز انجام شد.
.2.4 ارزیابی فعالیت حذف رادیکال هاي آزاد DPPH
براي سنجش میزان حذف رادیکال هاي آزاد،بر اساس روش Wu,Chen,Shiau - 2003 - مطالعه انجام شد البته با کمی تغییر، به این صورت که ابتدا پپتید هاي خالص شده در مرحله ي قبل با 1 ml آب دیونیزه حل شد سپس به آن 3 ml اتانول 95% اضافه شد و در نهایت 1 ml از - DPPH 0.15 mM در اتانول - 95% به آن اضافه شد. محلول حاصل به مدت 2 دقیقه توسط ورتکس با دور 1500 rpm به شدت هم خورد و براي مدت30 دقیقه در تاریکی قرار گرفت. سپس جذب آن توسط اسپکترفتومتر UV-visible در طول موج 517 nm خوانده شد. طبق معادله ي زیر درصد حذف رادیکال هاي آزاد محاسبه شد که در اینجا براي گرفتن جذب کنترل از اتانول به جاي نمونه استفاده شد.
5.2. سنجش فعالیت شلات کننده گی یون هاي فلزي
ارزیابی فعالیت شلات کننده گی بر اساس روش Decker و همکارانش - 1990 - با کمی تغییر انجام شد، به این ترتیب که ابتدا پپتیدهاي خالص شده در 1 ml آب دیونیزه حل شدند و به آن 0.05 ml دي کلرید آهن 2 mmol/l اضافه شد،به مدت 1 دقیقه به شدت توسط ورتکس با دور1,500 rpm مخلوط شد، پس از آن 2 ml آب دیونیزه به آن اضافه شد و در مرحله ي آخر 0.1 ml محلول فیروزین5 mmol/l به آن اضافه و به مدت 1 دقیقه توسط ورتکس با همان دور هم خورد،پس از 10 دقیقه جذب آن در طول موج 562 nm خوانده شد و اثر شلات کننده گی آن طبق رابطه ي زیر محاسبه شد. که در این رابطه به جاي نمونه از آب دیونیزه به عنوان کنترل استفاده شد.
.3 نتایج
نتایج سنجش پروتئین به روش برادفورد نشان داد که بطور متوسط، میزان پروتئین سفیده ي تخم شترمرغ - 49/6 mg/ml - ± 1 است. هضم آنزیمی با نسبت 20 به 1 سفیده با پروتئاز در دماي 37 درجه سانتی گراد انجام شد. نتایج نشان داد که بهترین زمان براي تولید فراورده هاي فعال آنتی اکسیدانت 4 ساعت است - شکل نشان داده نشده است - .
3.1 .خالص سازي پپتید ها به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - - HPLC
محلول پپتید حاصل از مرحله هضم پس از عبور از غشاء 1 کیلودالتون به ستون HPLC فاز معکوس 250 mm - C18 - 10 تزریق شد. فرکشن ها براساس زمان خروج و شدت جذب 214 nm، جمع آوري شد. در مجموع، 20 فرکشن جمع آوري شد - شکل - 1 پس از جداسازي فرکشن ها با کمک فریز دایر، پپتید ها خشک و مجداً در 0/5 ml بافر 50 میلی مولار pH 2 حل و براي آزمایش هاي بعدي از آن ها استفاده شد.
شکل ١. نمودار HPLC بدست آمده از ھیدرولیزات سفیده ي تخم شترمرغ را نشان می دھد. شماره ي فرکشن ھاي انتخابی در بالاي آن مشخص شده
