بخشی از مقاله
چکیده
استفاده از پایههاي اصلاحشده درختان میوه میتواند تاثیر زیادي در افزایش تولید وارزآوري داشته باشد. استفاده از پایه یوسی-بی-1 منجر به افزایش باردهی میگردد لذا تکثیر این پایه در کشور میتواند تاثیر زیادي در اقتصاد کشور داشته باشد. ترشح ترکیبات فنلی از محدودیتهاي تکثیر درونشیشهاي این پایه محسوب میشود لذا به منظور کنترل فنل آزمایشی با 48 تیمار طراحی گردید.
در طی آن ریزنمونهها درون غلظت و زمانهاي مختلف آسکوربیکاسید غوطهور شدند. همچنین به منظور بهبود پروتکل و استقرار از غلظتهاي مختلف زغال فعال در محیط کشت پایه MS استفاده شد. درنهایت نتایج حاکی از آن بود که استفاده ازتیمار 1 گرمبرلیتر زغال به همراه غوطهوري ریزنمونهها درون محلول 150 میلیگرمبرلیترآسکوربیکاسید به مدت 2 ساعت بیشترین تاثیر را درکنترل فنل و استقرار نشان داد و 80 درصد از ریزنمونهها فاقد هرگونه ترشح فنل بوده و66 درصد از آنها، استقرار یافتند.
مقدمه
تاکنون مکانیسمهاي زیادي براي تولید و قهوهاي شدن ترکیبات فنلی ارائه گردیده است که شناخت مکانیسم هریک ازاین عوامل میتوانددر کنترل تولید و ترشح و قهوهاي شدن بافتها به شدت موثر باشد. اگرچه روشهاي کارآمدي براي کنترل تولید و ترشح فنل تاکنون گزارش گردیده است ولی همچنان کنترل آن یکی از معضلات پیشروي محققیق میباشد.
یکی از مشکلات معمول که در استقرار ریزنمونههاي چنین گیاهانی وجود دارد اکسیدشدن ترکیبات فنلی میباشد . - Khatri et al., 1997 - کشت درونشیشهاي پسته همواره به خاطر تولید و ترشح ترکیبات فنلی، همواره با مشکلاتی روبرو است و در واقع مشکل اصلی در ریزازدیادي پسته ترشح ترکیبات فنلی ودرادامه اکسیداسیون آنها و مرگ ریزنمونه است. آسیب ریزنمونهها در طی کلیه مراحل، منجر به زخمی شدن سلولها و تولید و ترشح فنل میگردد.
همچنین به نظر میرسد مواد ضدعفونی کننده مانند قارچکشها، هیپوکلریدسدیم و کلریدجیوه منجر به ترشح و تولید فنل در طی روزهاي ابتدایی استقرار میگردند. به احتمال زیاد موادضدعفونی کننده باعث آسیب بافتها و ترشح ترکیبات فنلی گردند. یکی از مراحل ضروري در طی آماده کردن ریزنمونه به منظور کشت، ترمیم بافتهاي آسیب دیده میباشد ولی آنچه که مشخص است غوطه وري ریزنمونهها قبل از استریلیزاسیون منجر به ترمیم حاصل از برش و تهیه ریزنمونه میگردد و تاثیري بر کاهش اثرات حاصل از مواد ضدعفونی کننده نمیگذارد.
لذا غوطهوري مجدد ریزنمونهها درون محلول آنتی اکسیدانتی ضروري به نظر میرسد. ولی آنچه که مسلم است غوطهوري مجدد درون محلول آنتی اکسیدانی میتواند منجر به عدم بازشدن جوانهها و کاهش قدرت باززایی در مراحل بعدي گردد. زغال فعال یکی ازترکیباتی است که به منظور جذب ترکیبات فنلی به محیط کشت اضافه میگردد. زغال فعال داراي شبکه بسیار عالی از منافذ با مساحت سطح داخلی بالا که امکان جذب مواد را درون منافذ خود فراهم میکند . - Budavari, 1996; Mattson and Mark, 1971 زغال فعال به خاطر دارا بودن سطح فوق الاده بزرگ، منافذ بسیار و حجم منحصر به فرد آن در ظرفیت جذب حائز اهمیت است
علاوه بر این از زغال فعال هم درمحیط کشتهاي مایع و نیمه جامد به رسمیت شناخته شده است و بهخاطر جذب مواد بازدارنده کاهش شدید در اکسیداسیون فنلی و یا تجمع ترشحات قهوهاي - Carlberg et al., 1983; Liu, 1993; - در محیط کشت مورد استفاده قرار میگیرد. زغال فعال تمایل بیشتري براي جذب ترکیبات آلی قطبی مانند ترکیبات معطر مانند فنلها دارد - - Yam et .al., 1990 که زغال فعال علاوه بر جذب ترکیبات فنلی تاثیر بسزایی درغیرفعال کردن فعالیت آنزیم پراکسیداز و پلیفنلاکسیداز دارد .
به همین منظور احساس میشود استفاده از ترکیبات فنلی میتواند نقش مفیدي در کنترل یا تعدیل میزان فنلی شدن محیط داشته باشد به طوریکه استفاده از 0/3 درصد زغال فعال در محیط استقرار منجر به کنترل زردي در کشت درون شیشهاي پسته میشود
مواد و روشها
به منظور کنترل تولید و ترشحات ترکیبات فنلی و همچنین رفع مشکلات حاصل از ضدعفونی ریزنمونههاي پایه رویشی - P. integrima × P. atlantica - UCB1، آزمایشی به صورت فاکتوریل - با 4 فاکتور - بر پایه طرح بلوك تصادفی با 48 تیمار و 15 تکرار و هرتکرار شامل 4 ریزنمونه در آزمایشگاه کشت بافت گیاهی گروه علوم باغبانی دانشگاه تربیت مدرس انجام گرفت.
فاکتورهاي مورد مطالعه در این آزمایش شامل 4 سطح زغال فعال - صفر، 1، 2 و 3 گرم بر لیتر - و همچنین سه سطح آنتی اکسیدان آسکوربیکاسید - صفر و 0/5 میلیگرم بر لیتر - در سه زمان 0 - ، 2 و 4 ساعت - جهت غوطه وري و التیام ریزنمونهها بعد از پایان مرحله استریل کردن1 بود. مواد گیاهی مورد استفاده در این آزمایش از جوانههاي جانبی گیاهان مادري پایه رویشی پسته UCB1 رشد کرده در گلخانه تحقیقاتی دانشکده کشاورزي تربیت مدرس تهیه گردید. ضدعفونی نیز طبق روش توصیف شده توسط نظامی وهکاران - 1394 - انجام گردید.
به منظور استقرار ریزنمونهها از محیط کشت پایه موراشیک و اسکوگ - MS - تغییریافته به همراه سه درصدساکاروز و 6/2 گرم برلیتر آگارز استفاده گردید. همانطور که گفته شد، به منظور کنترل فنل و بهبود استقرار ریزنمونههاي پایه پسته UCB1، از غلظتهاي مختلف زغال فعال در محیط کشت استفاده گردید. صفات مورد مطالعه در این آزمایش شامل درصد زندهمانی جوانه - عدم ترشح فنل - ، درصد نمونههاي باززایی شده - استقرار - و درصد سوختگی انتهایی - زردي - جوانه بازشده بود.
تکنیک التیام بعد از استریل کردن - CAS -
در انتها به منظور رفع آسیبهاي صورت گرفته در مرحله آمادهسازي و رفع مشکل فنل، ریزنمونهها به مدت 0 - ، 2و 4 ساعت - درون غلظتهاي مختلف محلول آسکوربیکاسید 0 - ، 50، 100و 150میلیگرمبرلیتر - غوطهور گردیدند.
نتایج و بحث
نتایج آزمایشها حاکی از آن بود که تاثیرغلظتهاي مختلف زغالفعال، غلظت و زمانهاي مختلف غوطهوري در بر صفات مورد مطالعه - میزان ریزنمونههاي فنلی نشده و باززایی کرده - در سطح آماري یک درصد معنیدار گردید. تفاوت آماري معنی-داري بین غلظتهاي مختلف 0 - ، 1، 2 و 3 گرم برلیتر - زغال فعال مورد استفاده در محیط کشت، غلظت آسکوربیک اسید و مدت زمان غوطهوري وجود داشت.
مطالعه برهمکنش اثرات سهگانه غلظت زغال فعال، غلظت محلول آنتیاکسیدان و مدت زمان غوطهوري نشان داد که تفاوت معنیداري بین تیمارهاي مختلف بهکار رفته وجود داشت به طوریکه بیشترین میزان زندهمانی 66 - درصد - وعدم ترشح ترکیبات فنلی 80 - درصد - مربوط به تیمار 1گرم برلیتر زغالفعال+ غوطهوري درونمحلول 150میلیگرمبرلیتر آنتیاکسیدان به مدت دوساعت بود این درحالی است که بیشترین میزان سوختگی 100 - درصد - حاصل از ترشح و اکسیداسیون ترکیبات فنلی مربوط به تیمار شاهد - فاقد زغال فعال و بدون غوطهوري - بود و هیچکدام از ریزنمونهها استقرار نیافتند و در اثر ترشح ترکیبات فنلی و اکسیداسیون حاصل از آن ازبین رفتند. تولید و ترشح ترکیبات فنلی و اکسیداسیون آنها منجر به قهوهاي شدن بافت و محیط کشت میگردد که با ادامه این روند منجر به سیاه شدن و مرگ سلولی میگردد.
استفاده از آنتیاکسیدانها، غوطهوري درون آب مقطر دوبار استریل بعد ازاستریل کردن، غوطهوري درون محلول آنتی اکسیدان به صورت قبل و بعد از استریل کردن - Nezami et al., 2015c - استفاده از ترکیبات جذب کننده ترکیبات فنلی مانند زغال فعال - Jafarkhani et al., 2009 - و پلیوینیلپایریلیدون، تغییر غلظت عناصر محیط کشت پایه - Nezami, et al., 2015a - ، کاهش غلظت ساکارز، استفاده از آب جاري - - Zamir et al., 2007; Bon et al., 1988، تاریکدهی واتیوله کردن نهال مادري - - Nezami, et al., 2015b ، تلقیح گیاه مادري با قارچ مایکوریزا به منظور کاهش تنش - . Krishna, and Singh, 2008 ودرنهایت قرار دادن ریزنمونه کشت شده در محیط تاریک و یا با دماي پایین از اقدامات کنترل تولید و ترشح ترکیبات فنلی میباشد.
غوطه وري قبل از استریلیزاسیون با هدف ترمیم و التیام آسیب حاصل از برش و تهیه ریزنمونه صورت میگیرد و غوطهوري بعد از استریلیزاسیون به منظور به حداقل رساندن تاثیر منفی حاصل از مواد ضدعفونیکننده صورت میگیرد. نتایج آزمایشات حاکی از آن بود که غوطهوري ریزنمونهها درون محلولهاي آنتیاکسیدانی تاثیر بسزایی در کنترل فنل و قهوهاي شدن داشت. غوطهوري ریزنمونهها بعد از استریل کردن به مدت 2 ساعت درون محلول 150میلیگرم آسکوربسکاسید بدون در نظرگرفتن اثر سایرتیمارها منجر به کنترل 53درصدي فنل گردیدکه این موضوع با نتایج آزمایشهاي مطابقت داشت که اظهار داشتند غوطهوري ریزنمونه درون آب مقطر دوبارتقطیر به مدت 30 و 60 دقیقه منجر به موفقیت 55و 70 درصدي در کنترل قهوهاي شدن ریزنمونهها گردید
تصویر-1تاثیر تیمارهاي مختلف بر میزان استقرار ریزنمونههاي پایه ویشی یوسیبی-1 الف: محیط کشت شاهد - فاقد زغال فعال - و بدون غوطهوري بعداز استریلیزاسیون. ب: تاثیر غوطهوري بعد از استریلیزاسیون برباززایی نتایاج آزمایشات نشان داد که غوطهوري درون غلظتها 0 - ، 50، 100 و 150 میلیگرمبرلیتر - و زمانهاي مختلف 0 - ، 2 و 4ساعت - به تنهایی نتوانست منجر به کنترل کامل فنل و استقرار صد درصدي گردد
لذا به منظور بهبود کنترل فنل و استقرار ریزنمونههاي پایه یوسیبی1 از غلظتهاي مختلف زغال فعال نیز استفاده شد. محیط حاوي زغال فعال داراي پتانسیل بالایی در کنترل فنل دارد - Yam et al., 1990 - ، افزودن زغالفعال به محیطکشت پایه، به طورقابل توجهی قهوهاي شدن محیط را در کشت درونشیشهاي پسته کاهش داد - Safari et al., 2013 - که این موضوع با نتایج حاصل از آزمایش ما نیز مطابقت داشت. با افزایش غلظت زغال تاثیر منفی برکنترل ترکیبات فنلی داشت که احتمالا به خاطر افزایش اسمز محیط وایجاد تنش یا یافت ریزنمونه و در ادامه منجر به ترشح فنل میشد. زغال فعال به عنوان جاذب ترکیبات فنلی در کشت درون شیشهاي در چندین گونه از گیاهان خانواده آناکاردیاسه گزارش گردیده است.
