مقاله روش های ارزیابی ترکیبات فنلی و فعالیت آنتی اکسیدانی در گیاهان دارویی

بخشی از مقاله

چکیده

فرآیند اکسیداسیون امری ضروری برای بقای موجودات زنده جهت تولید انرژی برای فرآیندهای بیولوژیکی میباشد. اما نکته حائز اهمیت تعادل بین عوامل اکسیدکننده و آنتی اکسیدان جهت حفظ تعادل بین شرایط بهینه فیزیولوژیکی در بدن می باشد. ذخایر آنتی اکسیدان نقش موثری در کاهش اختلالات ناشی از افزایش تولید رادیکالهای آزاد ایفا میکنند. تاکنون مطالعات بسیاری با رودیکرد بررسی رادیکالهای آزاد، واکنش اکسیداتیو و فعالیت آنتی اکسیدانی مواد غذایی انجام شده است. برخی از محققان بیان کردند که دو سوم از گونههای گیاهی دارای ارزش دارویی هستند. به طور خاص، بسیاری از گیاهان دارویی، پتاسیل آنتی اکسیدانی بالایی دارند. آنتی اکسیدانها، استرسهای اکسیداتیو را در سلولها کاهش میدهند و بنابراین در درمان بسیاری از بیماریهای انسان از جمله سرطانها، بیماریهای قلبی عروقی و بیماریهای التهابی مفید هستند. امروزه آزمونهای زیادی جهت بررسی فعالیت آنتی اکسیدانی این ترکیبات به کار گرفته شده که بخش زیادی از آنها بر مبنای روشهای طیف نور سنجی استوار است. در این مقاله روشهای ارزیابی خواص آنتی اکسیدانی مورد بررسی قرار میگیرد.

کلمات کلیدی: پراکسیداسیون، فعالیت آنتی اکسیدانی، رادیکالهای آزاد، گیاهان دارویی.

-1 مقدمه
امروزه بسیاری از متخصصین تغذیه برای تأمین آنتی اکسیدان های مورد نیاز بدن، مصرف گیاهان، میوه جات و سبزیجات را توصیه مینمایند، زیرامعمولاً مصرف آنتی اکسیدانهای گیاهی عوارض جانبی کمتر و درمان بهتری ایجاد می نمایند نظر به این که گیاهان یکی از منابع مهم آنتی اکسیدان ها می باشند، تحقیقات در این زمینه رو به افزایش می باشد .[13] گیاهانی که غنی از ترکیبات آنتی اکسیدان بوده می توانند باعث حفاظت سلولها از آسیب های اکسیداتیو شوند .[22] آنتی اکسیدانهای طبیعی باعث افزایش قدرت آنتی آکسیدانهای پلاسما و کاهش ابتلا به بعضی بیماریها مانند سرطان، بیمارهای قلبی و سکته مغزی می شوند. متابولیت های ثانویه مشتق از گیاهان مانند فنول و فلاونوئید تام مشتق از گیاهان دارای پتانسیل قوی برای پاکسازی رادیکالهای آزاد می باشند که در تمام قسمتهای مختلف گیاهی مانند برگ، میوه، دانه، ریشه و پوست وجود دارند .[27] بنابراین با توجه به شیوع بالای بیماریهای مزمن و فرسایشی منطقی است که برای تأمین آنتی اکسیدانهای مورد نیاز بدن از گیاهان استفاده شود و به خصوص گیاهانی که فنول و فلاونوئید تام بالایی داشته باشند.

آنتی اکسیدانها موادی هستند که در غلظتهای کم قادر به پیشگیری و یا به تاخیر انداختن اکسیداسیون ناشی از گونههای فعال اکسیژن میباشند .[19] امروزه استفاده از آنتی اکسیدانهای سنتزی در پزشکی، کشاورزی و صنایع دارویی بسیار رواج یافته است. اما مطالعات متعددی حاکی از سمیت این آنتی اکسیدانها میباشد .[10] به همین دلیل یافتن آنتی اکسیدانهای طبیعی به ویژه از منابع گیاهی و استفاده از آنها در پزشکی، کشاورزی و صنایع دارویی بسیار مطلوب است تا علاوه بر داشتن اثرات بیولوژیک وسیع، احتمال ایجاد اثرات جانبی و مسمومیت با آن ها به خصوص در دوزهای کنترل شده کاهش یابد .[28] در سالهای اخیر مطالعات وسیعی بر روی گیاهان عالی و اسانسها و عصارههای حاصل از آنها برای یافتن ترکیبات آنتی اکسیدان انجام شده است. به طوری که گزارش شده است رابطه معکوسی بین سطح مواد آنتی اکسیدان موجود در بدن و بیماری های انسان وجود دارد .[11] ویتامین C، ویتامین E، سلنیوم، کاروتنوئیدها - بتاکاروتن، آلفاکاروتن، لیکوپن - فلزاتی مانند مس، منگنز، روی و فلاونوئیدهایی مانند کوئرستین - quercetin - ،

لوتئولین - Luteolin - و کاتچین - Catchin - از مهمترین آنتیاکسیدانهای طبیعی هستند .[15] در بین ترکیبات آنتی اکسیدان طبیعی پلی فنولها، فلاونوئیدها و ترکیبات فنولی که پراکندگی وسیعی در طبیعت دارند بسیار مورد توجه هستند . [25] موجب یک تاخیر بارز و یا حتی جلوگیری از اکسیداسیون آن سوبسترا خواهد شد. بنابراین پراکسیداسیون لیپید از دلایل اصلی فساد غذاست که منجر به تشکیل ترکیبات سمی می گردد. جلوگیری از اکسایش چربیها در مواد غذایی از اهمیت خاصی برخوردار است. به همین منظور امروزه در صنعت از آنتی بوتیلات، - BHA - اکسیدان های سنتزی مانند بوتیلات هیدروکسی آنیزول برای به - THBQ - و ترت بوتیل هیدروکینون - BHT - هیدروکسی تولوئن تاخیر انداختن اکسایش چربیها استفاده میشود، اما به دلیل اثرات مضر تغذیهای و سرطانزا بودن و نیز تمایل مصرف کنندگان به استفاده از ترکیبات طبیعی، کاربرد آنتی اکسیدان های طبیعی مورد توجه محققین قرار گرفته است . یکی از بهترین منابع آنتی اکسیدان های طبیعی ترکیبات فنلی موجود در بافتهای گیاهی است .[33] امروزه برای حذف یا کاهش ترکیبات سنتزی در مواد غذایی، حفظ و افزایش سلامت مصرف کنندگان و نیز دستیابی به آنتیاکسیدانهای طبیعی با قیمت پایین تر تحقیقات زیادی انجام شده است .[30]

-2 اهمیت آنتیاکسیدانها در درمان بیماریها

امروزه، رادیکالهای آزاد و عوامل اکسیدکننده جزء عوامل موثر در تشدید بسیاری از بیماریها مانند بیماریهای التهابی، دیابت، آلزایمر، سرطان، پیری و بیماریهای قلبی - عروقی شناخته شدهاند. بنابراین، پیشگیری و محافظت علیه این بیماریها توسط آنتی-اکسیدانهای آنزیمی و غیر آنزیمی صورت میگیرد .[3] بررسیها نشان داده است که آنتیاکسیدانها در جلوگیری از پراکسیداسیون لیپیدها نقش مهمی ایفا میکنند. این عمل از طریق افزایش سطح آنتیاکسیدانهایی از جمله آنزیمهای سوپراکسیددسموتاز و کاتالاز میباشد. این آنزیمها قادر به کاهش تولید محصولات نهایی پراکسیداسیون لیپیدها نظیر مالوندیآلدهید و هیدرو پروکسید میباشند. بنابراین در جلوگیری از بیماریهایی نظیر دیابت موثر هستند. آنتیاکسیدانها با کاهش آسیبهای اکسیداتیو به اسیدهای نوکلئیک، میتوانند خطر ابتلا به سرطان را کاهش دهند. چنانکه مطالعات زیادی بیان کننده ارتباط بین ویتامین C و کاهش خطر ابتلا به سرطان است .[14]

-3 تجزیه و تحلیل ترکیبات آنتی اکسیدانی

امروزه برای شناسایی دقیق آنتی اکسیدانها از روشها و تجهیزات گران قیمتی نظیر HPLC ، GC و یا اسپکترومتر جرمی - MS - استفاده می شود. تکنیک های آنتی بادی، به تشخیص پروتئینهای تغییر یافته، از طریق محصولات پراکسیداسیون چربی، کمک می-کند. به عنوان مثال، پروتئین های تغییر یافته توسط واکنش با آلدهیدهای اشباع نشده است. آزمایش فلوئورسانس، بر اساس این نظریه استوار است که آلدهیدها در هنگام پلی مریزاسیون، محصولات فلوئورسنت را در فقدان گروههای آمینه تشکیل میدهند. GC - کروماتوگرافی گازی - برای جداسازی استفاده می شود و میزان دقیق آنتی اکسیدانهای خاص را در ماتریکسهای مختلف تعیین می-کند. GC میتواند تعداد زیادی از ترکیبات مختلف، از توکوفرولها تا اسیدهای فنولیک را تعیین میکند. امروزه HPLC - کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا - به همراه GC، به یکی از قویترین روشهای تشخیص ترکیبات آنتی اکسیدانی خاص. - آسکوربیک اسید، توکوفرول ها، فلاوونوئیدها، اسیدهای فنولیک و غیره - تبدیل شدهاند هر چند این روشها دقت بسیار بالایی دارند ولی هزینه بالای سرمایه گذاری و کاربرد این روشها و نیز نیازمندی به دانش و تخصص بالا برای استفاده از این روشها، کاربرد آنها را محدود میکند .[17]

-4 مطالعههای انجام شده روی آنتی اکسیدانهای طبیعی

مهربان سنگ آتش و همکاران - 1394 - ، محتوی ترکیبات فنول تام، فلاونوئید و آنتی اکسیدانی عصاره های متانولی، دی کلرومتانی و اتیل استاتی اندام هوایی گیاه روناس صخره زی Rubia florida، مورد بررسی قرار دادند. نتایج نشان داد راندمان عصاره گیری به ترتیب بیشترین به کمترین متانولی< دی کلرومتانی < اتیل استاتی بدست آمد. بهترین فعالیت آنتی اکسیدانی در غلظت های بالاتر، عصاره ها حاصل شد و در میان حلال ها، عصاره متانولی پیشتاز بود و بیشترین مقدار ترکیبات فنل و فلاونوئید برای حلال متانول بدست آمد .[7] کمالی و همکاران - 1393 - ، محتوی ترکیبات فنول تام، فلاونوئید و آنتی اکسیدانی عصارههای مختلف از جمله هگزانی، دی کلرومتانی، اتیل استاتی و متانولی زرین گیاه Dracocephalum Kotschyi مورد ارزیابی قرار دادند.

نتایج نشان داد که فعالیت آنتی اکسیدانی وابسته به غلظت عصاره ها بود و همچنین بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی در عصاره متانولی و پایین ترین فعالیت در عصاره هگزانی مشاهده شد و محتوای فنل و فلاونوئید کل در عصاره متانولی بالاتر از بقیه عصاره ها بود، از طرفی رابطه مستقیم بین نتایج خاصیت آنتی اکسیدانی و محتوای فنل و فلاونوئید به دست آمد .[4] ابوطالبیان - 1385 - برای استخراج ترکیبات فنولی و فلاونوئیدی از گیاهان نعناع، پونه و ریحان از سه حلال آب، متانول %80 و اتانول %80 استفاده کرد و حلال متانول به عنوان بهترین حلال انتخاب شد. این محقق میزان استخراج ترکیبات فنولی با استفاده از متانول %80 را به ترتیب 58/16، 67/32، 23/83 میلی گرم معادل اسید تانیک در وزن خشک گیاه و ترکیبات فلاونوئیدی به ترتیب 52/8، 51/17، 45/19 میلی گرم معادل اپی کاتکین در وزن خشک گیاه گزارش کرد .[1]

پورفرزاد و همکاران - 1392 - ، نتایج به دست آمده از بهینه سازی شرایط استخراج فروکتان های پودر ریشه گیاه سریش با استفاده از امواج فراصوت و روش سطح پاسخ نشان داد که روش رویه پاسخ را می توان به خوبی در ارزیابی بازده این فرایند استخراج به کار برد و نیز نتایج آنالیز سه متغیر مستقل شامل زمان، دمای استخراج و شدت صوت حاکی از آن بودند که هر سه پارامتر موجب افزایش راندمان استخراج تیمارها شده اند. مشخص گردید که از میان این پارامترها، دما تاثیر بیش تری بر راندمان استخراج داشته است و زمان استخراج و شدت صوت نسبت به دما، تاثیر کم تری داشته اند .[3] رفیعی و همکاران - 1390 - ، در پژوهشی بر روی ویژگی های آنتی اکسیدانی عصاره برگ زیتون و کاربرد آن در روغن آفتابگردان نشان دادند که در میان حلال های مورد استفاده، بیش ترین و کم ترین میزان استخراج به ترتیب مربوط به عصاره های متانولی و عصاره های استونی بود .[5]

بهمن آبادی و همکاران - 1390 - ، بهینه سازی فرآیند استخراج ترکیبات فنولیک از عصاره متانولی %80 - حجمی- حجمی - میوه زرشک Berberis vulgaris توسط آزمون فولین سیوکالتو را انجام دادند. که بیشترین میزان استخراج ترکیبات فنولیک به میزان 15/2 میلی گرم گالیک اسید - استاندارد ترکیبات فنولیک - به ازای هر 1 گرم از پودر خشک گیاه ثبت شد .[2] شاددل و همکاران - 1390 - ، ترکیبات آنتی اکسیدانی و فنولیکی پوست بنه را با استفاده از روش مادون بحرانی آب استخراج کردند که بهترین دما 196/81 درجه سانتی گراد و بهترین زمان 57-52 دقیقه تعیین شد. تحت این شرایط میزان ترکیبات پلی فنلی، قدرت احیا کنندگی و قدرت مهارکنندگی رادیکال آزاد به ترتیب برابر با 2284 میلی گرم اسید گالیک1 در 100 گرم ماده اولیه، 0/2002 میلی گرم بر میلی لیتر و 0/6284 میلی گرم بر میلی لیتر به دست آمد .[6]

-5 روشهای ارزیابی فعالیت آنتی اکسیدانی

آزمایشهای فعالیت آنتی اکسیدانی مختلفی وجود دارد که هر کدام هدف خاص خودشان را دارند و همه آنها مزایا و معایبی دارند. برخی از این روشها از آنتی اکسیدانهای مصنوعی و رادیکالهای آزاد استفاده می کنند، برخی از آنها مخصوص پراکسیداسیون چربی هستند و مورد نیاز سلولهای گیاهی و جانوری هستند، برخی از آنها دامنه گسترده تری دارند، برخی از آنها به حداقل آماده سازی و دانش و چند معرف نیاز دارند. به عنوان مثال، آزمایش ABTS، یک آزمایش رنگ سنجی است که در آن رادیکال ABTS در حضور آنتی اکسیدان ها - کارتنوئیدها، ترکیبات فنولیک و غیره - رنگبری می شود .[26] یا روش DPPH بر این فرض استوار است که یک دهنده هیدروژن، یک آنتی اکسیدان می باشد.

این روش رنگ سنجی، از رادیکال DPPH استفاده میکند که در حضور آنتی اکسیدانها از ارغوانی به زرد تغییر رنگ پیدا می کند این روش به طور گستردهای که به عنوان یک مطالعه مقدماتی استفاده میشود .[22] آزمایش ERS - اسپکترومتری الکترون چرخش رزوناس - تنها روشی است که به طور خاص اجازه میدهد که رادیکالهای آزادی که در اتواکسیداسیون درگیر هستند، مشخص شوند .[9] آزمون تیوباربیتوریک اسید - TBA - ، در این روش غلظت نهایی نمونه 0/02 درصد و 2 میلی لیتر از تری کلرواستیک اسید 20 درصد و 2 میلی لیتر تیوباربیتوریک اسید 67 درصد به 1 میلی لیتر از محلول نمونه اضافه شده، سپس مخلوط به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده شده و سپس بعد از خنک شدن در3000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. فعالیت جذوبی مایع رویی در طول موج 552 نانومتر اندازه گیری شد و بعد از اینکه به حداکثر خود رسیده بود، ثبت شد .[29]