مقاله جداسازی وشناسایی عامل بیماری کپک خاکستری انگور در استان آذربایجان غربی

بخشی از مقاله

چکیده

انگور یکی از محصولات مهم منطقه آذربایجان غربی بوده و در طول دوره پس از برداشت به آلودگی های قارچی به ویژه قارچ کپک خاکستری بسیار حساس است. نشانه های بیماری معمولا ابتدا روی میوه های رسیده یا درحال رسیدن انگور ظاهر می شود. اما گاهی روی گلها یا میوه در مرحله قبل از رسیدن نیز ایجاد می شود. در تحقیق حاضر به منظور شناسایی مورفولوژیکی و مولکولی جدایه های قارچ عامل بیماری کپک خاکستری، از باغات انگور استان آذربایجان غربی در مرحله رسیدن انگور و همجنین در مرحله پس از برداشت میوه بازدید و نمونه های آلوده به کپک خاکستری به آزمایشگاه منتقل شدند.

از نمونه ها پس از ضدعفونی سطحی برش هایی تهیه و روی محیط کشت PDA کشت شدند. خصوصیات مورفولوژیکی از جمله رنگ کلنی، شکل و رنگ و ابعاد کنیدیفور، اندازه کنیدی و شکل و ابعاد اسکلروت ها، برای شناسایی جدایه ها بکار رفت. اندازه کنیدی ها 3 - 12 × 4 - 8 طول کنیدیوفورها 650 - 2800 میکرومتر و ابعاد اسکلرت ها 1 - 7 1-10 × بود. در بررسی ژنوتیپی، جدایه ها توانستند قطعه 700 جفت بازی را با استفاده از پرایمر C729 را تولید کنند. براساس مجموع ویژگی های مورفولوژیکی و ژنوتیپی، جدای های عامل کپک خاکستری انگور در استان آذربایجان غربی به عنوان Botrytis cinerea شناسایی شدند.
کلمات کلیدی: اتگور، آذربایجان غربی، کپک خاکستری، Botrytis cinerea

.1 مقدمه

انگور یکی از محصولات مهم منطقه آذربایجان غربی بوده و در طول دوره پس از برداشت به آلودگی های قارچی به ویژه قارچ کپک خاکستری بسیار حساس است. آلودگی با قارچهای بیماریزا در مرحله پس از برداشت از طریق حمله مستقیم قارچهای بیماریزا و یا از طریق فعالیت مجدد عوامل بیماریزای راکدی که حمله اولیه را در مزرعه انجام داده اند بوجود می آیند .[3] این فعالیت مجدد را می توان به کاهش در مقاومت طبیعی به بیماریها در بافت ها نسبت داد .[11] کاهش مقاومت طبیعی به بیماریها به مواردی از قبیل فراهمی مواد غذایی مورد نیاز عوامل بیماریزا، کاهش ترکیبات ضد قارچ پیش ساخته - فایتو آنتی سیپین ها - ، توقف القای سنتز ترکیبات ضد قارچ جدید - فایتو آلکسین ها - و تقویت فاکتورهای عفونت زای عامل بیماریزا مربوط دانست .[8]

بررسی مراحل ایجاد آلودگی با قارچ B. cinerea یک واکنش چهار مرحله ای را به تصویر می کشد که شامل اتصال ماده تلقیح - کنیدیا - به سطح بافت میزبان، شناسایی سطح میزبان توسط ماده تلقیح، جوانه زنی ماده تلقیح و در نهایت ورود ماده تلقیح به بافت هدف و تولید اسپور است .[12] به نظر می رسد نفوذ این قارچ به جای این که با یک فشار مکان یکی انجام شود با تولید آنزیم های تجزیه گر و یا نوعی انفجار اکسایشی توام باشد. مطالعات نشان می دهند که تجمعی از رادیکال سوپر اکسید در انتهای هیف های قارچ دیده می شود که به داخل و اطراف بافت مورد حمله انتقال می یابد. آلودگی با قارچ Botrytis میتواند نشانگر یک تنش اکسایشی باشد.

گزارش ها نشان دهنده تجمع قندهای احیاگر در شرایط تنش زا هستند .[10] به نظر می رسد که آلودگی با قارچ B. cinerea در طی انبارداری میوه انگور رابطه جالبی با تغییرات قندهای احیاگر داشته باشد.این قارچ توسط کنیدیوفورهای مستقیم و بند بند، هیف ضخیم و پرگنه خاکستری، کنیدی های بیضوی تا تخم مرغی و تک سلولی و اسکلورت های سیاه مشخص می شوند. اسکلرت ها در بقایای گیاهی زمستان گذارنی می کنند. دمای ایده ال برای رشد این قارچ 25 تا 30 درجه و ماکزیمم 37 تا 40 درجه سیلسیوس است. گونه های بوتریتس به دلیل داشتن کنیدیوم هایچند هسته ای و سازگاری رویشی دارای تغییرات ثابتی در طول دوره ی تولید مثل در شرایط آزمایشگاه و محیط های زراعی هستند. تغییرات فنوتیپی و ژنوتیپی در گونه B. cinerea معمول است. B. cinerea یکی از پاتوژن های قارچی نکروتروف است .[13]

این قارچ روی دامنه وسیعی از گیاهان میزبان به صورت یک ساپروفیت یا پارازیت رشد می کند و گاهی حالت بیماری شدید روی گیاهان زینتی، سبزیجات یا حتی نهال های درختان ایجاد می کند. این بیمارگر خصوصا در هوای مرطوب توسعه می یابد. گونه B. cinerea یک بیمارگر مهم میوه های انباری و همچنین میوه های در حال حمل و نقل است. این قارچ از بدو تشکیل غنچه های گل می تواند وارد اندام های اولیه تشکیل میوه شود و تا زمان رسیدگی میوه انجا بماند و یا در زمان نرم شدن یا صدمه خوردن میوه وارد شده، در داخل یا روی میوه فعالیت تخریبی خود را آغاز کند. این کپک ها در هنگام بارندگی و هوای مرطوب صدمات بیشتری می زنند.

عامل بیماری در هوای گرم فعالیت بهتری دارد و در دمای نزدیک به صفر هم، با شدت کمتری به توسعه خود ادامه می دهد. میوه برداشت شده از حساسیت بیشتری نسبت به این بیماری برخوردار است. در ایران این قارچ روی مرکبات، گلایول، رز، ختمی، پیاز و توت فرنگی نیز گزارش شده است. این قارچ برای رشد مطلوب خود نیاز به آب و هوای خنک و مرطوب دارد. بیمارگر در دمای پایین فعال است و خسارت قابل توجهی روی محصولات یا دوره انبارداری طولانی ایجاد می کند .[11]اندازه کنیدیفور 2999-662 میکرومتر و اندازه کنیدی ها بین 4-8*6-13 میکرومتر و ابعاد اسکلروت ها 8-1*.36-1 میلی متر می باشد .[5] طبقه بندی بوتراتیس بیشتر براساس خصوصیات مورفولوژیک و رشد روی محیط کشت همراه با اختصاصی بودن میزبان بنا شده است .[4] شکل و اندازه اسکلروتیوم و اندازه کنیدیوم در جداسازی بعضی گونه ها مفیدند. اما تعداد زیادی از گونه ها از نظر مورفولوژی مشابه ند و شرایط رشدی مشخصا در تنوع آنها موثر است.

B. cinerea معمول ترین گونه این جنس است که روی دامنه وسیعی از گیاهان میزبان به صورت پارازیت یا ساپروفیت رشد میکند اما اکثر گونه های دیگر دامنه مزبانی محدودتری دارند. بیشترین تخصص میزبانی در تک لپه ای ها و تعدادی از دو لپه ای های خانواده باقلا، شمعدانی و آلاله اتفاق می افتد .[3]از آنجاییکه استان آذربایجان غربی یکی از مراکز مهم تولید انگور است و هر ساله در مراحل خوشه دهی، برداشت و پس از برداشت محصول نیز از بیماری پوسیدگی خاکستری خسارت می بیند لذا جهت مدیریت و کنترل این بیماری لازم است تا عامل آن به طور دقیق شناسایی شده و خصوصیات آن بررسی شود لذا هدف از این تحقیق جداسازی و شناسایی عامل بیماری پوسیدگی خاکستری انگور در استان آذربایجان غربی می باشد.

.2 تئوری و پیشینه تحقیق

کپک خاکستری ناشی از قارچ Botrytis cinerea از بیماریهای عمده انگور میباشد، این قارچ باعث کاهش عملکرد وآثار نامطلوب روی کیفیت انگور میشود. خسارت های جهانی پس از برداشت برای بیشتر محصولات بین 10 تا 30 درصد تخمین زده می شود و در بعضی محصولات فاسدشدنی خسارت بالاست بین 30 تا 50 درصد که غیرمعمول است. در بین تمام عوامل بیمارگر گیاهی، 25 گونه قارچ بعد از برداشت محصولات گیاهی هستند. در میان آنها گونه هایی از جنس Botrytis و مخصوصا گونه B. cinerea بیمارگر اصلی میوه های حمل شده، سبزیجات و گیاهان زینتی گلخانه ها هستند. این گونه یک قارچ بیمارگر گیاهی است که عامل کپک خاکستری روی بیش از 230 میزبان می باشد .[3]

این قارچ اغلب به بافت های پیر و صدمه دیده حمله می کند و قادرست در گیاهان در دمای پایین تا 2 درجه سانتی گراد ایجاد بیماری نماید و موجب مشکلات زیادی در زنجیره های پس از برداشت گردد. تلاش قابل ملاحظه ای به منظور حفاظت محصولات زراعی در مقابل قارچ بوتریتیس قبل و بعد از برداشت انجام گرفت. ارزش اقتصادی برای فراورده های ضد بوتریتیس 15-25 میلیون دلار در سالهای اخیر بوده است. با وجود اهمیت این پاتوژن، در مورد این قارچ مطالعات کمی در ایران وجود دارد.در تحقیقی که آلفونسو و همکاران [1] برروی جمعیت های B. cinerea روی محصولات گلخانه های در اسپانیا انجام دادند که نتایج نشان دهنده تفاوت ژنتیکی زیاد و گوناگونی های موفولوژیکی زیادی در ساختار جمعیت های B. cinerea بود.

مویانو و همکاران 44 [6] جدایه از اسپانیا ار به کمک آزمون RAPD مورد بررسی قرار دادند و گزارش کردند فقط دو گروه متفاوت وجود دارند که شامل بیش از یک عضو هستند، یکی از گروه ها از 3 جدایه و دیگری از دو جدایه تشکیل شده است که شامل جدایه های مقاوم به قارچ کش پروسیمیدون و حساس به بنزیمیدازول بودند که در یک دسته قرار گرفتند.در ایران برای اولین بار قارچ B. cinerea از انگور جداسازی شده و به منظور شناسایی گونه مورد نظر از ویژگی های مورفولوژیکی استفاده شد و همچنین به منظور قطعیت بیشتر در شناسایی گونه در جدایه ها بررسی مولکولی با استفاده از توالی یابی نواحی ITS1 و ITS2 و توالی 5/8 دی ان ای ریبوزومی انجام شد.

اما با توجه به تفاوت زیادی که در شکل و اندازه اسکلروت ها، کنیدیوم و کنیدیفور در جدایه ها مشاهده شده بود تعیین توالی مناطق بیشتری از ژنوم قارچ و استفاده از آغازگرهای اختصاصی پیشنهاد شده است. همچنین شناسایی چندین گونه از جنس بوتریتیس توسط میرزایی و همکاران صورت گرفت .[5] امین و همکاران.[2] به بررسی فراوانی عناصر جهنده در جدایه های گونه B. cinerea پرداختند. این عناصر با نام Boty و Flipper در دو رده مجزا قرار دارند. دسته اول عناصری هستند که توسط رونویسی یک mRNA منقل می شوند اما دسته دیگر در سطح دی ان ای و با بریده شدن بخشی از دی ان ای و جانشینی در مکانی دیگر منتقل می شوند. Boty یک قطعه kb 6 است که به صورت تکرارهای طویل و انتهایی و به تعداد زیاد از توالی خاصی در طول ژنوم مشخص می شود.

قطعه Flipper، kb 1842 بوده و به تعداد 20 نسخه در هر ژنوم وجود دارد. این عناصر یکی از عوامل تفاوت ژنتیکی استرین ها در گونه B. cinerea هستند.از زمانیکه بوتراتیس توسط میشلی در سال 1729 نامگذاری شد. این تاکسون به عنوان یک جنس شناخته شد .[3] ارتباط بین Botrytis spp. و فرم جنسی آنها - Botryotinia - سرانجام در طول سالهای دهه 1940 و 1950 مشخص شد .[7] B. cinerea با فرم جنسی Botryotinia fuckeliana یک قارچ هاپلوئید، رشته ای و هتروتال است و به دلیل داشتن کنیدیها و بخش های هیفی چند هسته ای، جدایه های بوترایتس تمایل به تغییر مداوم در مدت تکثیر موفق در آزمایشگاه و تحت شرایط مزرعه ای دارند .[3]

.3مواد و روش ها

در سال 1394 در طی خوشه دهی و مرحله برداشت میوه انگور، از تاکستان های استان آذربایجان غربی بازدید و از نمونه های مشکوک به آلودگی به کپک خاکستری نمونه بردای و به آزمایشگاه منتقل شد. در آزمایشگاه از نمونه های آلوده اسلاید تهیه و زیر میکروسکوپ بررسی شدند. پس از اطمینان به آلوده بودن نمونه ها به قارچ بوتریتیس جهت بررسی های تفصیلی و شناسایی گونه قارچ عامل بیماری، در محیط PDA کشت گردیدند.به منظور شناسایی قارچ، تمام جدایه ها روی محیط PDA و در دمای 20 تا 22 درجه سانتی گراد به مدت 7 روز در روشنایی قرار داده شده و خصوصیات مورفولوژیکی قارچ از جمله طول کنیدیوفور، ابعاد کنیدیوم و اسکلرت قارچ اندازه گیری شد.

برای تهیه اسکلروت قارچ، محیط کشت حاوی قارچ در تاریکی و دمای 8 درجه سانتی گراد نگهداری گردید. برای اندازه گیری، ابعاد 60 کنیدیوم و طول 50 کنیدیدیفر در هر جدایه با بزرگ نمایی 40 میکروسکوپ برای هر جدایه اندازه گیری شد و همچنین شکل و رنگ پرگنه قارچ، شکل کنیدیوم و شکل، رنگ و نحوه توزیع اسکلروت قارچ روی محیط PDA مشاهده و بررسی شد. خصوصیات مورفولوژیکی طبق کلید شناسایی الیس مورد بررسی قرار گرفت .[3]