بخشی از مقاله
چکیده
کشت درون شیشه ای، تکثیر یکنواخت گیاهان را در مدت زمان کم تسهیل نموده و ابزاری جدید جهت اصلاح مدرن و دست ورزی ژنتیکی گیاهان به شمار میرود.اما پایین بودن میزان ریشهزایی درون شیشهای مشکل عمده در پروتکلهای ریزازدیادی مرکبات میباشد. هدف از این پژوهش، توسعهی پروتکل موثری جهت ریشهزایی شاخسارههای درونشیشهای نارنج میباشد. در این پژوهش به منظور به دست آوردن شاخساره، ریزنمونههای اپیکوتیل و هیپوکوتیل نارنج در محیط MS حاوی BAP - 2mg/l - و - 0/2 mg/l - NAA کشت شدند و پس از باززایی به محیط کشت القای ریشه شامل محیط کشت MS حاوی غلظت های مختلف 5 mg/l - IBA،1،0/2، - 0 منتقل شدند. در پایان طول، قطر و تعداد انشعاب ریشه در هر شاخساره بررسی شد. به طورکلی ریشهزایی با استفاده از ایندولبوتریکاسید افزایش یافت.
کلمات کلیدی: باززایی،گیاهان چوبی، القای ریشه، ایندولبوتریک اسید
مقدمه
در سالهای اخیر توجه زیادی به نقش غذا در سلامتی انسان شده است. از همین نقطه نظر، مرکبات که دارای ترکیبات مهمی چون ویتامین C، فولیکاسید، فلاونوئیدها، اسانسها و آلکالوئیدهایی مثل پیلوکارپوس و کوسپارین میباشند، جزء باارزشترین گیاهان مثمر جهان به حساب میآیند - . - 5 در این بین نارنج به علت تأثیرات فارماکولوژیک وسیع از جمله ممانعت از اکسیداسیون لیپوپروتئینها و جلوگیری از تجمع پلاکتها، جزء ارقام مهم این گونه میباشد - . - 1 از اینرو است که تولید این محصول باارزش در دنیا بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. اما یکی از مشکلات پیش روی تولیدکنندگان مرکبات، آفات، بیماریها و علفهای هرز در باغهای مرکبات است که هر ساله خسارات زیادی به وجود میآورد.
کاهش عراضی کشاورزی و کمبود فضای لازم برای تولید محصولات گیاهی نیز مزید بر علت شده و نیاز به استفاده از علوم نوین همچون کشت بافت را در تولید و مقاوم-سازی و پرورش این محصولات باارزش، بیش از پیش نمایان میکند. کشت بافت گیاهی، پتانسیلهای بیشماری جهت بهکارگیری در بخش علوم گیاهی دارد. کشت سلول، بافت و اندام های گیاهی امکان تکثیر سریع و انبوه ژنوتیپهای مطلوب و تولید گیاهان یکسان را فراهم می سازد. اما از مشکلات عمده در کشت بافت مرکبات - به ویژه رقم نارنج - سرسختی است. در واقع مرکبات به دلیل پایین بودن سطح اندامزایی درونشیشهای، جزء گروه گیاهان سرسخت می باشند. معضل بزرگ ریشهدار کردن شاخههای تولید شده در شرایط in vitroعامل محدودکنندهی بزرگی در پروتکلهای کشتبافتی حال حاضر مرکبات است [6] و همین امر ریزازدیادی نارنج را دچار مشکل میسازد.
اگرچه مکانیسمهای مولکولی القای ریشه هنوز ناشناخته مانده اما نقش محوری اکسین خارجی در این رابطه ثابت شدهاست.[8] فاز ریشه زایی با اضافه کردن مقادیر مختلف اکسین به محیط کشت آغاز می شود.[7] افزودن اکسین به محیط کشت، اغلب مشکل ریشهزایی را در گیاهان چوبی که به سختی ریشهدار می شوند حل کرده است. مطالعات سوارز فیلیو و همکاران - 2011 - [9] که بر روی دو کلتیوار از پرتقال شیرین انجام شد، نشان داد که NAA در تمایز ریشه اهمیت دارد اما ترکیب آن با IBA برای طویل شدن ریشه ضروریست. در گزارشاتی درباره ژنوتیپهای Citrus aurantifolia و Citrus limon بیان شده که با افزایش غلظت IBA در ترکیب با سایر اکسینها در ریشهزایی پاسخ افزایشی دیده شد. [3] این پژوهش با هدف تولید گیاهچهی کامل نارنج در شرایط in vitro و رفع مشکلات ریشهزایی درونشیشهای مرکبات برداشته شود.
مواد و روش ها
جهت تهیه ی ریزنمونه، میوه های تازهی نارنج تهیه شد. بذور نارنج از میوه های تازه و سالم خارج شده و پس از جدا کردن پوسته خارجی، ضدعفونی سطحی شدند. برای ضدعفونی، بذرها در محلول 2 درصد هیپوکلریت سدیم به همراه توئین با غلظت 1درصد به مدت 15 دقیقه به آرامی تکان داده شده سپس 3 مرتبه با آب استریل هر مرتبه به مدت 3 دقیقه شستشو شدند. در ادامه بذور به مدت یک دقیقه در اتانل 70 درصد قرار گرفته و3 مرتبه با آب مقطر استریل آبکشی شدند. بذ رهای ضد عفونی شده به محیط جوانه زنی شامل نمک های کامل محیط کشت MS ، ویتامین های کامل MS، 30 گرم در لیتر ساکارز، 7 گرم در لیتر آگار pH=5/8 منتقل و برای مدت 4 تا 6 هفته در 27 - 1 درجه سانتیگراد در شرایط تاریکی نگهداری شدند. گیاهچه های اتیوله حاصل از بذور نارنج کشت شده در تاریکی، برای تهیه ی ریزنمونه ها استفاده شدند. ابتدا لپه ها، ریشه و برگ ها و ساقه های زاید جدا شده و سپس از گیاهچه ها ریزنمونه به طول تقریبی 1 سانتی متر تهیه شد.
در نهایت ریزنمونه ها به پلیت های حاوی نمک های کامل محیط MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز ، 7 گرم در لیتر آگار و تنظیم کننده های رشد مربوط با pH= 5/8 منتقل شدند. تنظیم کننده های رشد مورد استفاده 2 میلی گرم در لیتر BAP و 0/2 میلی گرم در لیتر NAA بود. پس از 3 الی 4 هفته، ریزنمونه هایی که دارای جوانه هایی به طول 2 میلی متر شدند، به محیط رشد شاخساره شامل نمک های کامل محیط کشت MS، ویتامین های کامل MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز ، 7 گرم در لیتر آگار، 1 میلی گرم در لیتر GA3 منتقل شدند. پس از این که شاخساره های حاصل از باززایی ریزنمونه ها به اندازه ی حداقل 1 سانتی متر رسیدند، از ریزنمونه ها جدا شده و به محیط القای ریشه شامل نمک های محیط کشت MS، ویتامین های کامل MS ، 30 گرم در لیتر ساکارز و غلظت های مختلف 5 - IBA،1،0/2،0 میلی گرم در لیتر - منتقل شدند. پس از حدود 6 هفته، طول ریشه، قطر ریشه و تعداد ریشه در هر شاخساره اندازه گیری شد. آزمایش ها در قالب طرحکاملاً تصادفی انجام شده و آنالیز داده ها با نرم افزار9/2 SAS انجام گرفت.
نتایج و ﲝث
در این پژوهش اثر سطوح مختلف IBA بر ریشه زایی شاخسارههای درون شیشهای نارنج مورد بررسی قرار گرفت. فقط شاخسارههایی به طول حدود 1 سانتی متر به محیط القای ریشه منتقل شدند. بر این اساس تاثیر حضور IBA در این آزمایشات، افزایش میزان ریشه زایی بود.
