بخشی از مقاله
چکیده
آنزیم بتاگالاکتوزیداز - از نوع مخمر کلویورومایسس لاکتیس - به روش ریزپوشانی در سدیمآلژینات و کربوکسیمتیلسلولز با ترکیب درصدهای مختلف - w/v - تثبیت شده است. نقطهی بهینه با استفاده از روش پاسخ سطح در %1,85 سدیمآلژینات، %0,9 کربوکسیمتیلسلولز و %2 کلسیم کلرید با میزان تثبیت %54,94 و فعالیت ویژه %65,27 بدست آمد. این آنزیم در حالت آزاد در دمای 45 C و 6,5 pH و در حالت تثبیت شده در دمای 45 C و 7 pH دارای بیشترین فعالیت ویژه است. پایداری حرارتی آنزیم آزاد و تثبیت شده در دماهای 37 ، 45 و 55 C بررسی شد. نتایج نشان میدهد تثبیت باعث افزایش پایداری حرارتی میشود و با افزایش دما، پایداری حرارتی آنزیم هم در حالت آزاد و هم در حالت تثبیت شده کاهش مییابد. آنزیم تثبیت شده که با دستگاه خشککن انجمادی خشک شد، در دورهی چهارم استفادهی مجدد قادر است %57 لاکتوز شیر را به گلوکز و گالاکتوز تبدیل کند. بررسی پایداری حرارتی آنزیم تثبیت شده در دمای اتاق و دمای یخچال در مدت زمان دو ماه نشان میدهد آنزیم تثبیت شده باید در یخچال نگهداری شود.
کلمات کلیدی: آنزیم بتاگالاکتوزیداز، ریزپوشانی، سدیمآلژینات، کربوکسیمتیلسلولز، پایداری حرارتی
-1 مقدمه
مصرف محصولات لبنی به دلیل حضور لاکتوز کاهش یافته است زیرا حلالیت و شیرینی لاکتوز - قند اصلی شیر - کم و بسیاری از مردم به بیماری عدم تحمل لاکتوز مبتلا هستند .[5] مقدار زیاد لاکتوز در بعضی از محصولات لبنی مانند بستنی باعث ایجاد بافت دانهای نامطلوب میشود، بنابراین باید از محصولات لبنی حذف شود .[12,14] یکی از راههای مناسب برای حذف لاکتوز از محصولات لبنی، استفاده از آنزیم بتاگالاکتوزیداز - E.C.3.2.1.23 - است زیرا در شرایط معمولی دما و pH عمل میکند و گزینشپذیری بالایی دارد .[3,10,13]
بتاگالاکتوزیداز که نام دیگر آن لاکتاز است لاکتوز را به دو مونوساکارید گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند .[20] منابع میکروبی مختلف برای تولید این آنزیم وجود دارد اما اکثر آنزیمهای صنعتی از مخمر کلویورومایسس لاکتیس، کلویورومایسس فراجلیس و قارچ آسپرژیلوس نایجر، آسپرژیلوس اوریزه تولید میشوند .[9] در طول یک دههی اخیر به تثبیت لاکتاز توجه زیادی شده است .[21] تثبیت فواید زیادی دارد که عبارتند از: استفادهی مجدد از آنزیم، کنترل بهتر فرآیند، گزینش پذیری بیشتر، تبدیل بیشتر سوبسترا به فرآوردهها، افزایش پایداری آنزیم و امکان استفاده از فرآیند پیوسته .[7,17] از میان روشهای مختلف تثبیت لاکتاز، روش محبوس کردن آنزیم در ژل کلسیمآلژینات به دلیل آسانی فرآیند و غیر سمی بودن آن پیشنهاد میشود. در این روش مخلوط آنزیم در ژل آلژینات تهیه و سپس در محلول کلسیمکلرید به صورت قطره قطره تزریق میشود تا کپسولها تشکیل شوند .[1,18,21]
اما در این روش مقدار زیادی آنزیم - پروتئین - به صورت تثبیت نشده وارد محلول کلسیم کلرید میشود. برای نخستین بار Dashevsky میزان از دست رفتن آب را در طول تشکیل کپسولها برای تثبیت لاکتاز در ژل آلژینات بررسی کرد. وقتی مخلوط تهیه شدهی آنزیم و آلژینات داخل محلول کلسیمکلرید اکسترود میشود گروههای کربوکسیلات موجود در مونومرهای گلورونات آلژینات به کاتیونهای کلسیم متصل میشود و وزن دانههای تشکیل شده کاهش مییابد زیرا با اتصال عرضی آلژینات پدیدهی فشردگی رخ میدهد و آب به بیرون کپسول نشتی میکند در نتیجه پروتئین محلول در آب از دست میرود. بنابراین مادهی به شدت جاذب آب مانند بنتونبت را به محلول آلژینات اضافه کرد و میزان تثبیت لاکتاز را افزایش داد .[1]
محققان دیگری هم آلژینات را با پلیمرهای آبدوست مانند ژلاتین [4]، هیدروکسیپروپیلمتیلسلولز [2] به عنوان ماتریس جدید برای تثبیت لاکتاز یا پروتئین ترکیب کردند اما از دست رفتن پروتئین هنگام تشکبل کپسولها را بررسی نکردند. کربوکسیمتیل سلولز از مشتقات محلول در آب سلولز است که توانایی بالایی در تشکیل ژل دارد زیرا به شدت جاذب و نگهدارندهی آب است. این پلیمر کاربرد زیادی در صنایع غذایی دارد .[11,16] برای نخستین بار Mai و همکاران از مخلوط آلژینات با کربوکسیمتیلسلولز در غلظت ثابت 0,2 مولار کلسیمکلرید برای تثبیت لاکتاز استفاده کردند و توانستند به میزان تثبیت %58,2 برسند که %14,2 بالاتر از تثبیت با ژل آلژینات بود .[19]
هدف از این پژوهش تثبیت آنزیم لاکتاز به روش ریزپوشانی در حامل مناسب برای رسیدن به بالاترین میزان تثبیت و فعالیت به طور همزمان است. برای تشکیل کپسولها از ترکیب درصدهای مختلف سدیم آلژینات و کربوکسی متیل سلولز در غلظتهای مختلف کلسیم کلرید استفاده شده است. کپسولهای حاصل از حالت بهینهی تثبیت از لحاظ قابلیت استفادهی مجدد سنجش شدند. همچنین پروفایل دما، پروفایل pH و پایداری حرارتی آنزیم آزاد و تثبیتشده بررسی شد.
-2 مواد و روشها
از شیر معمولی استریلیزه شرکت تولید فرآوردههای لبنی کاله آمل با لاکتوز تقریبا %5 و لاکتوز مونوهیدرات از شرکت Merck آلمان به عنوان سوبسترا برای اندازهگیری فعالیت آنزیم لاکتاز در موارد مختلف استفاده شد. آنزیم بتاگالاکتوزیداز با نام Biolactase L از شرکت تولید فرآوردههای لبنی کاله آمل تهیه شد. این آنزیم در شرکت Kerry ایرلند از نژاد به خصوصی از مخمر کلویورومایسس لاکتیس تولید میشود. سدیمآلژینات و کلسیمکلرید از شرکت BDH و کربوکسیمتیلسلولز از شرکت Sigma Aldrich آمریکا خریداری شد. از دستگاه گلوکوکارد شرکت ARKRAY ژاپن برای اندازهگیری گلوکز محلول استفاده شد.
-1-2 سنجش فعالیت آنزیم لاکتاز
مقدار 50 میلیلیتر شیر معمولی که دارای تقریبا %5 لاکتوز و pH تقریبا 6,5 است در ارلن ریخته و در حمام آب 45 C گذاشته شد. مقدار 0,1 میلیلیتر آنزیم لاکتاز به آرامی به شیر اضافه شد و بعد از 10 دقیقه، ارلن از حمام آب خارج و در آب جوش به مدت 5 دقیقه قرار گرفت. سپس مقدار گلوکز آزاد شده با نوار گلوکوکارد اندازهگیری شد .[19] یک واحد فعالیت آنزیم - U - برابر است با مقدار آنزیمی که بتواند یک میکرومول گلوکز در شرایط تعریف شدهی واکنش در یک دقیقه تولید کند. اگر عدد حاصل بر جرم پروتئین تقسیم شود به آن فعالیت ویژهی آنزیم - U/mg - گفته میشود.
-2-2 تاثیر دما و pH بر فعالیت آنزیم لاکتاز
محلول های - w/v - %5 لاکتوز مونوهیدرات در بافر پتاسیم هیدروژن فتالات با 5,5 pH و بافر پتاسیم فسفات با pH های مختلف 6، 6,5، 7، 7,5 و 8 تهیه شد. هر محلول بر حسب نیاز در دماهای مختلف 20 تا 55 درجهی سانتیگراد با 5 درجه افزایش در حمام آب گذاشته شد. سپس فعالیت آنزیم لاکتاز مشابه بخش 1-2 اندازهگیری شد .[8,19]
-3-2 پایداری حرارتی آنزیم لاکتاز
مقداری آنزیم لاکتاز در دمای 37 C در انکوباتور به مدت 240دقیقه گذاشته شد که مقدار 0,1 میلیلیتر از آن در هر 40دقیقه از انکوباتور خارج و فعالیت آن مشابه بخش 1-2 اندازهگیری شد .[19] به فعالیت حاصل، فعالیت باقیمانده گفته میشود که بر حسب درصد فعالیت اولیهی آنزیم قابل گزارش است. این آزمایش علاوه بر دمای 37 C در دماهای 45 و 55 C نیز تکرار شد.
-4-2 تثبیت آنزیم در ژل آلژینات و کربوکسی متیل سلولز
تاثیر پارامترهای غلظت سدیمآلژینات از %1 تا %3، کربوکسیمتیلسلولز از %0 تا %1,2 و کلسیمکلرید از %1 تا %5 بر حسب - w/v - بر میزان تثبیت و فعالیت آنزیم تثبیت شده بررسی شد .[19] جدول - 1 - تعیین محدودهی مناسب برای متغیرها را نشان میدهد که این مقادیر به نرم افزار Design-Expert داده و آزمایشهای مناسب طراحی شد. برای هریک از آزمایشها دو پاسخ در نظر گرفته شد که پاسخ اول مربوط به میزان تثبیت بر حسب درصد است و پاسخ بعدی مربوط به فعالیت آنزیم تثبیت شده بر حسب درصد فعالیت آنزیم آزاد میباشد. در طراحی آزمایشها از طراحی بر مبنای central composite استفاده شد که تقریبا معمولترین حالت طراحی این نرمافزار میباشد. هدف از انجام آزمایش ها بهینه کردن شرایط تثبیت برای رسیدن به بیشترین میزان تثبیت و بیشترین میزان فعالیت باقیمانده به صورت همزمان بود که هر دو هدف به نرمافزار داده شد.
-1-4-2 تثبیت به روش ریزپوشانی
5 میلی لیتر آنزیم به 10 میلیلیتر ژل آماده شده اضافه و با همزن مغناطیسی به مدت نیم ساعت بهم زده شد. سپس با سرنگ 5 میلیلیتری، 2 میلیلیتر از این مخلوط برداشته و در 100 میلیلیتر محلول کلسیمکلرید با غلظت مشخص به صورت قطره قطره - با سرعت ثابت و از فاصلهی معین - تزریق شد. دو ساعت زمان کافی است تا کپسولها در محلول کلسیم کلرید تشکیل و سفت شوند. سپس با استفاده از یک صافی معمولی، کپسولها جدا و با 50 میلیلیتر آب مقطر شسته شدند .[19]
-2-4-2 تعیین میزان تثبیت آنزیم
