بخشی از مقاله
چکیده
برای شناخت جایگاه ژن میوستاتین در گوسفند لری و ارتباط ژنوتیپ ها با صفات وزن تعداد 50 رأس به طور تصادفی انتخاب و خونگیری گردید. ژنوتیپ های Mm و mm در جایگاه ژن میواستاتین در جمعیت گوسفند لری مشاهده شدند. بررسی ارتباط بین ژنوتیپ های شناسایی گردیده با صفات رشد به جز برای وزن تولد غیر معنی دار بود. بنابراین آلل های جایگاه ژن میوستاتین تثبیت گردیده و مارکرمناسبی در مطالعات ژنتیکی و پیوستگی با صفات رشد محسوب نمی گردد.
مقدمه
روش های متعددی جهت افزایش گوشت در دام ها به خصوص در گاو و گوسفند وجود دارد، انتخاب دام های برتر از نظر ژنتیکی یکی از مهمترین روش ها است. از طرفی گوسفند لری مهمترین نژاد گوسفند گوشتی بومی ایران است، که دارای توانایی ژنتیکی بالایی برای تولید گوشت میباشد. لذا بررسی ژنها مؤثر بر تولید گوشت در این نژاد میتواند در انتخاب و اصلاح آن اهمیت داشته باشد.رشد چشمگیر در توسعه مطالعات بیولوژیکی و به ویژه ژنتیک مولکولی، تعیین توالی نوکلئوتید ها و شناسایی مستقیم ژن ها بر روی اکثر گونه های دامی، تمایل محققین در انجام مطالعات مولکولی در سطح DNA را افزایش داده است. یکی از ژن های شناسایی شده جهت افزایش رشد و گوشت و بهبود کیفیت لاشه ژن میواستاتین - ماهیچه مضاعف - است. مطالعات برای یافتن ژن های به وجود آورنده عضله مضاعف در گاو های گوشتی منجر به کشف ژن میواستاتین شد، که به عنوان ژن کاندیدا برای صفت تولید گوشت مورد بررسی قرار گرفته و نقش آن در نژادهای مختلف دام و طیور و حتی انسان شناخته شده است. مطالعات مولکولی ژن میواستاتین نشان داد چند شکلی در بین دام ها وجود دارد . - 4 - اولین اسناد و نوشتهها در-باره ماهیچه مضاعف در گاو به دهه 1807 میلادی بر میگردد . - 14 - گزارشاتی مبنی بر این وجود دارد که 9 جهش در ناحیه کد کننده ژن میواستاتین منجر به تغییرات غیر مشابهی در ژنوتیپ دام ها میگردد، که 3 تا از آنها موتاسیونهای بیمعنی هستند. 2 موتاسیون در اگزون 1 و موتاسیون دیگر در اگزون 2 این ژن واقع شده است. 6 موتاسیون باقیمانده در اگزون های 2 و3 قرار دارند، که منجر به ایجاد رمز پایان زودرس میگردد، که این موتاسیونها مسئول فنوتیپ ماهیچه مضاعف هستند. . - 6 - ژن میواستاتین یک تنظیم کننده منفی جهت رشد ماهیچه های اسکلتی است، که اگر جهشی در ناحیه کد کننده این ژن اتفاق بیفتد، باعث تغییر نقش تنظیم کنندگی این ژن شده و افزایش عضله را سبب می گردد 7 - ، 12 و . - 13 در مطالعه انجام گرفته بر روی گوسفند تکسل در ناحیه ژن میوستاتین بر روی کروموزوم شماره 2 گوسفند جهت شناسایی ژن های کاندیدا صفات لاشه از 8 مارکر ریزماهواره ای جهت تعیین ژنوتیپ دام ها استفاده گردید. هیچ مدرکی دال بر ژن کاندیدا در ناحیه مورد مطالعه برای صفات سرعت رشد و لاشه به دست نیامد، اما در مورد صفت چربی و ماهیچه ران وجود ژن کاندیدا برای افراد هتروزیگوت واقع بین نشانگرهای BM81124 وBULGE20 ثابت گردید . - 12 - در جمعیت گوسفندان سفید نروژی 20 جهش تک نوکلئوتیدی در ژن میواستاتین گزارش شده است، که موجب تغییر در کیفیت لاشه و میزان چربی می گردد. جهش در نواحی c.2360 G>A و c.960del G باعث افزایش عملکرد لاشه با چربی کمتر و حجم ماهیچه ای بیشتر شده است. . - 8 - بنابراین هدف از مطالعه اخیر بررسی چندشکلی ژنی در اگزون 3 جایگاه میوستاتین و ارتباط آنها با صفات وزن در گوسفند لری می باشد.
مواد و روش ها
نمونه های مورد استفاده و استخراج DNA
جهت انجام این تحقیق نمونه های خون از سیاهرگ گردنی گوسفندان و با استفاده از سرنگ های 5 میلی متری گرفته شد، بلافاصله وارد لوله های خلا 2/5 میلی متری حاوی ماده ضد انعقاد 0/5 - EDTA درصد - گردید و جهت حفاظت نمونه در داخل یخ قرار گرفت و به پژوهشکده زیست فناوری دانشگاه زابل، بخش آزمایشگاه ژنتیک مولکولی انتقال داده شدند. استخراج DNA از نمونه های خون به روش استخراج نمکی - کیت دنا زیست - انجام گرفت و برای تعیین کیفیت و غلظت DNA استخراج شده با استفاده از روش الکترفورز مقایسه ای بر روی ژل آگارز 1 درصد با ولتاژ90 استفاده گردید.
تکثیر جایگاه ژن میوستاتین و هضم آنزیمی با HaeIII
تکثیر قطعه 373 جفت باز از ناحیه 3 'UTR ژن میوستاتین با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی که بر اساس توالی ژنومی در گوسفند طراحی گردید توسط واکنش - Sinagen Co. - PCR انجام گرفت. واکنش تکثیر در حجم 20 میکرولیتر انجام گرفت، که شامل 2 میکرو لیتر بافر PCR، 0/6 میکرولیترdNTP، 0/8 میکرولیتر Mgcl2، 0/2 میکرولیترآنزیم Taq، 0/5 میکرو لیتر از مخلوط پرایمرها، 2 میکرولیتر از DNA استخراج شده می باشد و حجم نهایی با آب مقطر دو بار تقطیر به 20 میکرولیتر تنظیم گردید. واکنش شامل یک برنامه حرارتی 95 درجه برای واسرشته سازی اولیه به مدت 10 دقیقه و در ادامه 40 سیکل با دماهای 95 درجه سانتی گراد برای واسرشته سازی ثانویه به مدت 45 ثانیه، دمای 58 درجه سانتی گراد به منظور اتصال آغازگرها به مدت 55 ثانیه و دمای 72 درجه برای بسط آغازگرها به مدت 45 ثانیه و نهایتا آخرین مرحله بسط نهایی در دمای 72 درجه به مدت 10 دقیقه در دستگاه ترموسایکلر انجام گرفت. جهت وضوح محصولات PCR از الکتروفورز ژل آگارز 2 درصد با ولتاژ80 به مدت 45 دقیقه استفاده گردید. محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز به کمک آنزیم برشی HaeIII مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند. نتایج هضم آنزیمی بر روی ژل آگارز % 2 با ولتاژ 70 به مدت 2 ساعت الکتروفورز گردید. پرایمر های مورد استفاده به شرح ذیل هستند: تجزیه معیار های جمعیتی شامل آللهای مشاهده شده و مؤثر، هتروزیگوسیتی، شاخص نئی و شانن، آماره F در درون جمعیت و نهایتا بررسی تعادل یا عدم تعادل در جایگاه مورد مطالعه با نرم افزار - Yeh et al., 1999 - POPGENE3.2 انجام گرفت. تجزیه آماری ارتباط ژنوتیپ های جایگاه میوستاتین با صفات وزن برای بررسی ارتباط بین هاپلوتیپهای ژن میواستاتین با صفات وزن تولد، 3 ماهگی و 6 ماهگی از مدلهای خطی ثابت و رویه GLM با نرم افزار - 2009 - SAS انجام گرفت، که مدل عبارتست از:
که در معادله بالا Yijkl بردار هر یک از صفات وزن، Sexi اثر ثابت جنس، BTj اثر ثابت تیپ تولد، Gk اثر ثابت ژنوتیپ حیوان و eijkl خطای باقی مانده است.
نتایج و بحث
نتایج استفاده از روش استخراج نمکی بهینه یافته برای استخراج DNA از نمونه خون از لحاظ کمیت و کیفیت DNA وصرف زمان لازم در استحصال DNA برتری خوبی را نشان داد - شکل . - 1 قطعه 373 جفت باز از ژن میوستاتین با واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، برنامه حرارتی مناسب بدون قطعات غیراختصاصی تکثیر گردید، که با نتایج تیموتی و همکاران - 17 - بر روی انسان، گاو، گوسفند و بز مطابقت داشت - شکل . - 2
شکل:1 کیفیت DNA استخراج شده روی ژل آگارز %1 - چاهک اول: ladder و سایر چاهک ها مربوط به 6 نمونه -
شکل -2 محصول PCR برای جفت پرایمر MSTN - قطعه 373جفت بازی - بر روی ژل آگاروز %2
پس از هضم محصول PCR توسط آنزیم HaeIII محصولات هضم روی ژل آگارز 2 درصد الکتروفورز گردید و قطعات حاصل از هضم آنزیم برشی نمایان گردید، که از بین 3 ژنوتیپ MM، Mm و mm تنها دو ژنوتیپ Mm و mm در این مطالعه مشاهده گردید. - شکل - 3
شکل -3 الکتروفورز محصولات حاصل از هضم توسط آنزیم HaeIII و ژنوتیپ حیوانات در جایگاه ژن میوستاتین
معیارهای جمعیتی و ژنتیکی شامل فراوانی آللها، هتروزیگوسیتی، آماره F و عدم تعادل با نرم افزارPOPGENE برآورد گردید، که نتایج درجدول 1 و2 نمایش داده شده است. آللm دارای بیشترین فراوانی - %91/25 - و آلل M دارای کمترین فراوانی - % 8/75 - و متناسب با آنها بیشترین فراوانی ژنوتیپی مربوط به ژنوتیپ mm - %82/5 - و کمترین ژنوتیپ مربوط به - %17/5 - Mm بودند. صوفی - 2 - در مطالعه جایگاه ژن میوستاتین در نژاد گوسفند سنجابی فراوانی ژنوتیپ های مشاهده شده را به ترتیبMm= %1/33 ، MM=%2 ،mm=%96/76 گزارش نمود، که آلل های m و M به ترتیب دارای فراوانی 0/97 و 0/03 بودند. همانگونه که مشاهده می گردد در گوسفند سنجابی بیشترین فراوانی مربوط به ژنوتیپ mm می باشد، مقایسه فراوانی آللی نشان می دهد، که نتیجه حاصل از تحقیق اخیر با نتیجه صوفی - 2 - مطابقت دارد، اما در تحقیق صوفی 3 - 2 - ژنوتیپ گزارش شده است. همچنین نتایج مطالعه اخیر با مطالعات دوراک و همکاران - 9 - بر روی گاو های نژاد کارولیاس مطابقت دارد، ولی با نتایج ولر و همکاران - 18 - در نژادهای گاو پیدمانس مغایرت دارد، که دلیل این امر به علت وقوع بالای فنوتیپ ماهیچه مضاعف در گاو پیدمانس می باشد. مطالعه انجام گرفته در نژاد قره گل در جایگاه ژن میوستاتین هیچ جهشی در اگزون 3 ژن نشان نداد . - 18 - نهایتا نتیجه بررسی چند شکلی جایگاه ژن میوستاتین در نژاد های ماکویی و زل فاقد تنوع گزارش گردید . به منظور بررسی تنوع ژنتیکی جمعیت لری استان لرستان در جایگاه ژن میوستاتین پارامترهایی همچون، هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده محاسبه گردید،که در جدول1 آورده شده است. در مطالعه اخیر هتروزیگوسیتی مورد انتظار و مشاهده شده به ترتیب برابر با 0/16 و 0/175 برآورد گردید. مولائی و همکاران - 5 - متوسط هتروزیگوسیتی مشاهده شده در شش نژاد بومی ایران را در جایگاه ژن میوستاتین 0/64 گزارش کردند. شاخص اطلاعات شانن - I - در کل جمعیت، محاسبه گردید، که برابر با 0/3 می باشد، که دلالت بر پایین بودن میزان تنوع ژنتیکی در کل جمعیت دارد. همچنین، شاخص نئی جایگاه ژن میوستاتین در جمعیت لری 0/16 محاسبه شد، که نشان می دهد
