بخشی از مقاله
چکیده
ویروس موزائیک کوتولگی ذرت - Maize dwarf mosaic virus, MDMV - یکی از مهمترین و گستردهترین ویروس ذرت در دنیا میباشد. تحقیق حاضر بمنظور تعیین ترادف ناحیه 5 ’ ژنوم ویروس شامل قطعهاي با 3460 نوکلئوتید انجام گردید. بدین منظور گیاهان ذرت با علائم موزاییک و کوتولگی از استان گلستان جمع آوري شد. پس از تعیین آلودگی با آزمون الایزا با آنتی سرم MDMV یک نمونه آلوده براي استخراج RNA انتخاب گردید.
جهت تکثیر ناحیه 5 ’ - UTR از جفت آغازگر اختصاصی این ناحیه استفاده گردید، سایر ژنها نیز با استفاده از 4 جفت آغازگر اختصاصی تکثیر و سپس همسانهسازي گردید. قطعه حاصل از ترادف ژنهاي P1 ، HC-Pro ، P3 ، 6k1 و قسمت 5 ’ - UTR شامل 3460 نوکلئوتید بود. آنالیزهاي مقایسهاي ترادف نوکلئوتیدي جدایه MDMV نشان داد که جدایه ایران - گلستان - به ترتیب داراي شباهت 95/7 و 92/3 درصد در سطح آمینواسیدي و 90/5 و 85/1 درصد در سطح نوکلئوتیدي با جدایههاي بلغارستان و اسپانیا میباشد. ترادف نوکلئوتیدي این قسمت از ژنوم کامل MDMV در ایران براي اولین بار گزارش میشود.
مقدمه
ذرت یکی از مهمترین غلات در دنیا میباشد. عوامل مختلفی از جمله ویروسها در کشت ذرت محدودیت ایجاد کردهاند. یکی از مهمترین و گستردهترین بیماري ویروسی ذرت، ویروس موزاییک کوتولگی ذرت - Maize dwarf mosaic virus, - MDMV میباشد MDMV . - 1 - ، یک ویروس با RNA تک رشتهاي مثبت با پیکرهاي به ابعاد 13×750 نانومتر میباشد . - 6 - ژنوم این ویروس همانند سایر اعضاي خانواده پوتیویریده داراي تنها یک چارچوب ژنی - open reading frame, ORF - میباشد، که یک پلی پروتئین بزرگ را کد میکند. که در دو انتهاي آن نواحی ترجمه نشونده - UTR - قرار دارد . - 5 - پلی پروتئین به 10 پروتئین کوچکتر تقسیم میشود که هر یک براي گونههاي تعیین ترادف شده در بین اعضاي این خانواده نقش مشخصی دارند، ژن P1 در تعیین دامنه میزبانی نقش دارد، ژن HC-Pro براي انتقال با شتهها نیاز است و ژنهاي P3 و 6k2 احتمالا membrane anchors در فرایند نسخه برداري هستند .
- 2 - تاکنون ترادف نوکلوتیدي 126 جدایه از MDMV تعیین شده است، که در این میان بخش اعظم آن شامل ناحیه CP بوده است، و تنها در 2 ترادف کامل از ژنوم این ویروس که در Gen Bank قرار دارد، نواحی ابتداي ژنوم که شامل P1 ، HC-Pro ، P3 ، 6k1 و ناحیه 5 ’ - UTR میباشد موجود است AJ001691.1 - ، - AM110758.1 .در ایران تا کنون بخشی از ناحیه CP جدایههاي اصفهان، ساري و گرگان تعیین ترادف شده است . - 4 - در اینجا بمنظور تعیین ترادف کامل ژنوم ویروس، نمونههاي ذرت از استان گلستان جمع آوري گردید که در حال حاضر ترادف ناحیه 5 ’ ژنوم یکی از نمونههاي انتخاب شده تعیین ترادف گردیده است، که در این مقاله گزارش میشود.
مواد و روشها گیاهان ذرت آلوده به ویروس موزاییک کوتولگی ذرت تشخیص داده شده در آزمون الایزاي غیرمستقیم با استفاده از روش معصومی و ایزدپناه 1379 خالص سازي شدند، که روش تغییر یافته minipurification میباشد 3 - وRNA . - 4 ویروس با استفاده از mRNA capture kit طبق دستورالعمل شرکت سازنده از گیاهان ذرت آلوده استخراج گردید، نسخه برداري معکوس به روش معمول با آنزیم Mmulv و آغازگر معکوس N1T انجام گردید. cDNA بدست آمده از این روش یراي تکثیر قطعات در برگیرنده ژنهاي P1 ، HC-Pro ، P3 ، 6k1 و ناحیه 5 ’ - UTR در واکنش PCR توسط آغازگرهاي اختصاصی که بصورت همپوشان طراحی شدند استفاده گردید - جدول . - 1
MDMV جدایه گلستان
برنامه PCR براي هر آغازگر شامل 35 چرخه با دماي واسرشته سازي اولیه 94 درجه سانتی گراد به مدت 4 دقیقه و سنتز نهایی در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت 15دقیقه انجام شد و دماي مناسب آغازگرهاي ویروس مطابق جدول 1 بکار برده شد. محصول PCR پس از تایید در ژل آگارز - % 1 شکل - 1، بوسیله Fermentas, - Clone JET PCR Cloning Kit - Lithunia طبق دستورالعمل سازنده در پلاسمید pJET1.2 وارد و در باکتري E.coli استرین XL-Blue همسانهسازي گردید، پلاسمیدها سپس با کیت استخراج پلاسمید - Fermentas - طبق دستورالعمل شرکت سازنده استخراج گردیدند، همچنین محصول PCR تعدادي از آغازگرها بوسیله - Bioneer - PCR Purification kit طبق دستورالعمل شرکت سازنده خالص سازي گردید و به همراه پلاسمیدها براي تعیین ترادف به شرکت Techdragon - هنگ کنگ - ارسال شدند.
الف - باند حاصل از MDMV1F / 1R ، ب - باند حاصل از MDMV2F / 2R ، ج - راهک 1 از راست باند حاصل از MDMV3F / 3R و راهک 2 باند حاصل از MDMV4F / 4R ، د - راهک 1 از راست باند حاصل از Pot F0 / SP3 در آنالیزهاي فیلوژنتیک تشابه ترادف آمینو اسیدي این جدایه با 2 جدایه اروپایی ویروس و سایر پوتیویروسهاي غلات که ترادف نوکلئوتیدي کامل آنها در GenBank قرار داشت با نرم افزار Clustal X و MegAlign بررسی شد. همچنین درخت فیلوژنی حاصل از ترادفهاي مذکور به روش maximum-parsimony با برنامه MEGA5 بدست آمد. در این آنالیزها ویروس موزاییک رگه اي گندم - Wheat streak mosaic virus, WSMV - به عنوان outgroup مورد استفاده قرار گرفت.
نتایج و بحث آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده بخوبی قطعات مورد نظر را تکثیر کرده که از مجموع آنها قطعهاي به طول 3460 نوکلئوتید بدست آمد که از ابتداي ژنوم ویروس موزاییک کوتولگی ذرت شروع شده و به انتهاي ژن 6K1 ختم میشود. ناحیه 5 ’ - UTR شامل 139 و نواحی P1 ، HC-Pro ، P3 و 6K1 به ترتیب شامل 699 ، 1380، 1041 و 201 نوکلئوتید بودند که در این نواحی موتیفهاي PTK، KITC و CCC که در انتقال ویروس با شته نقش دارند، وجود داشت. که این موتیف ها در جدایه بلغاري و اسپانیاییMDMV نیز وجود دارند. پس از همردیف سازي جدایه گلستان با جدایه بلغاري ویروس - - AJ001691.1 و جدایه اسپانیا - AM110758.1 - تشابه ترادف آمینو اسیدي جدایه گلستان با جدایههاي مذکور به ترتیب 95.7 و 92.3 درصد تعیین شد که این موضوع نشان دهنده شباهت بیشتر جدایه گلستان به جدایه بلغارستان میباشد.
همچنین در مقایسه با سایر پوتیویروسهاي غلات بیشترین شباهت با ویروسهاي موزاییک سورگوم از تگزاس و موزاییک نیشکر از چین به ترتیب 72/9 و 72/3 درصد مشاهده شد. در درخت فیلوژنی بدست آمده نیز جدایه ایران در کنار جدایههاي بلغارستان و اسپانیا قرار گرفت، و گروه جداشده از اینها گروهی شامل ویروسهاي موزاییک سورگوم میباشد - شکل . - 2 تعیین جایگاه تاکسونومیکی سویه ایرانی MDMV و مقایسه آن با سایر سویههاي دنیا میتواند منشا تکاملی و پیدایش این سویه در ایران را روشن سازد. بر اساس اطلاعات موجود و شباهتهاي این سویه با سایر سویههاي اروپایی بنظر میرسد که احتمالا MDMV در ایران چنانچه در مطالعات قبلی نیز بیان شده است - 7 - منشا خارجی داشته باشد. نتایج بدست آمده در این تحقیق اطلاعات قبلی بدست آمده از آنالیز ژن CP را نیز تایید میکند.
