بخشی از مقاله
چکیده:
در مطالعه حاضر فاصله ژنتیکی در درون و بین دو جمعیت گوسفند سنجابی - شامل اکوتیپ هاي کژل، کلول و زردي - و کردي - شامل اکوتیپ هاي کوهستان، دشت و خراسان - با استفاده از 15 جفت آغارگر ریز ماهواره - ,OARFCB304 ,OARFCB11 ,NCM527 ,MAF214 ,CSRD247,D5S2 ,HSC ,INRA063 ,INRA005 ,OARAE129 ,OARCP49 ,OARFCB20 ,MAF65 ,، SPS113، - INRA023 بررسی گردید.
واکنش هاي PCR با تمام آغازگرها به جز آغازگر INRA023 به خوبی انجام گرفت. کمترین و بیشترین فاصله ژنتیکی Ds به ترتیب بین اکوتیپ هاي کلول و کژل از جمعیت سنجابی - 0/0148 - و کلول از نژاد سنجابی و کردي خراسان - 0/5376 - به دست آمده است.
در درخت فیلوژنتیک حاصل از معیار Ds که با روش جفت گروهی غیر وزنی از طریق میانگین حسابی - UPGAM - ترسیم گردید، دو شاخه مجزا مشاهده گردید. شاخه اول مربوط به جمعیت سنجابی است که در راس شاخه، دو اکوتیپ کژل و کلول در یک زیر شاخه و اکوتیپ زردي نیز در زیرشاخه دیگر قرار دارد. در شاخه دیگر جمعیت کردي قرار دارد، که اکوتیپ دشت و کوهستان در یک زیر شاخه و اکوتیپ خراسان نیز در زیر شاخه دیگر قرار دارد.
مقدمه:
نی - - Nei فاصله ژنتیکی را بعنوان معیاري از اختلاف بین جمعیتها تعریف می نماید که بصورت تابعی از فراوانی ژنی بیان می گردد و یک معیار آماري استاندارد را - بصورت یک عدد - براي تعیین میزان تفاوت ژنتیکی فراهم می آورد.
اگر هیچ تفاوتی وجود نداشته باشد، فاصله صفر خواهد بود و در صورتی که جمعیت ها در هیچ جایگاهی آلل مشترك نداشته باشند، فاصله میان آنها برابر با حداکثر مقدار خود یعنی یک خواهد بود. به نظر می رسد فاصله ژنتیکی به زمان بستگی دارد چرا که جمعیت هاي مورد مقایسه از یک جمعیت اجدادي انشقاق می یابند. مقایسه این جمعیت ها بنوبه خود نیاز به یک مدل ژنتیکی دارد که در آن فرآیندهایی مانند جهش و رانش، که موجب انشقاق جمعیت ها می گردند، منظور می شود.
فواصل ژنتیکی ممکن است بطور ساده بعنوان ابزارهایی براي تبدیل داده ها، یا بعنوان ابزارهایی براي مقایسه جمعیت هاي موجود و یا بعنوان مبنایی براي تشکیل سوابقذتکاملی جمعیت ها در نظر گرفته شوند. این اهداف متفاوت نیازمند فواصل متفاوت می باشند و بویژه استنباط فیلوژنی ها به مدل هاي ژنتیکی نیاز دارد
انواعی از معیارهاي فاصله ژنتیکی ابداع شده اند که برخی از این معیارها توسط نی و تاکازاکی - 1994 - و گلداستئین و پالوك - 1997 - بیان شده است
در مطالعات تکاملی، طبقه بندي شامل تشکیل فیلوژنی نیز می گردد. درختان فیلوژنتیک مسیرهاي تکاملی را نشان می دهند و می توان از آنها براي درك روابط تکاملی استفاده نمود . به عبارت دیگر هر چه موجودات مورد بررسی مشابهت بیشتري در مولکولهاي توارثی داشته باشند، خویشاوندي نزدیکتري دارند. در بیشتر موجودات از داده هاي مربوط به توالی DNA براي تعیین روابط تکاملی استفاده می شود. از آنجائیکه چنین داده هایی - در مقایسه با داده هایی مانند داده هاي ریخت شناختی - کمتر تحت تأثیر نتایج انتخاب قرار می گیرند، بهتر می توانند روابط فیلوژنتیکی واقعی را بازتاب دهند
مواد و روش ها:
ابتدا از جمعیت هاي مختلف گوسفند کردي و سنجابی در سطح استان هاي کردستان، خراسان شمالی، کرمانشاه و ایلام، 450 نمونه خون بصورت تصادفی تهیه گردید. نمونه گیري از هر توده نژادي بطور تصادفی از 10 درصد بره هاي متولد شده در هر یک از گله ها انجام گردید. در آزمایشگاه از هر نمونه 5 میلی لیتري خون نخست گلبول هاي قرمز توسط بافرلیزکننده از گلبول هاي سفید جدا گردیدند. سپس گلبول هاي سفید تمام شب در مجاورت بافر هضم کننده حاوي پروتئینازk در حرارت 37 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
پس از انجام شستشو و جداسازي DNA توسط اتانول و کلروفورم، در نهایت با استفاده از اسپکتروفتومتري و ژل مونینورینگ کمیت و کیفیت DNA نیز تعیین گردید. جهت انجام PCR از 15 نشانگر ریزماهواره شامل ,OARFCB304 ,OARFCB11 ,NCM527 ,MAF214 ,CSRD247 ,D5S2 ,HSC ,INRA063 ,INRA005 ,OARAE129 که توسط انجمن بین المللی ژنتیک معرفی شده بودند، استفاده گردید.
براي تعیین دقیق تر اندازه تمامی باندهاي فرآورده هاي PCR ، از 3 نشانگر اندازه استفاده شد. جهت جدا سازي قطعات تکثیر یافته از یکدیگر، محصولات PCR به مدت 2- 3 ساعت در ولتاژ 200 الکتروفورز گردیدند. رنگ آمیزي ژل با استفاده از نیترات نقره صورت گرفت. براي خواندن آللها، ژل رنگآمیزي شده اسکن گردیده و با استفاده از نرمافزار UvDoc فاصله باندها از چاهکها اندازهگیري شدند. با استفاده از فاصله باندهاي نشانگر اندازه و وزن هر باند، وزن آن الل را به صورت bp بدست آوردیم.
براي تعیین فراوانی هاي آللی و ژنوتیپی و سایر پارامترهاي مربوط به جایگاهها و جمعیت از نرم افزارهايPopGene و PIC-VALUE استفاده گردید. جهت تعیین اندازه آلل ها نرم افزارPhotocapture مورد استفاده قرار گرفت و به منطور تشکیل ماتریس فواصل ژنتیکی براي هر یک از دو معیار فاصله ژنتیکی یعنی فاصله ژنتیکی استاندارد نی - - DS و فاصله ژنتیکی DA با 1000 بار خود راه اندازي و نیزترسیم درخت فیلوژنتیک با دو روش معمول و مبتنی بر ماتریس فاصله ژنتیکی یعنی روش پیوند همجواري و روش جفت گروهی غیر وزنی از طریق میانگین حسابی با 1000 بار خود راه اندازي، از نرم افزار POPTREE استفاده شد
نتایج و بحث:
ماتریس فواصل ژنتیکی با استفاده از معیار نی، - Ds - 1974 در جدول 1- آورده شده است . همانطور که مشاهده می گردد.
کمترین فاصله، بین اکوتیپ کلول و اکوتیپ کژال - - 0/0148 ، بین اکوتیپ کژال و اکوتیپ زردي - - 0/0172 و بین اکوتیپ کلول و اکوتیپ زردي - - 0/0475 می باشد. با توجه به هم منشاء بودن سه اکوتیپ زردي ، کژال و کلول و همچنین حضور هر سه اکوتیپ در بین گله هاي نژاد سنجابی قابل توجه می باشد .
فاصله ژنتیکی کم بین این سه اکوتیپ در شباهت فنوتیپی بسیار زیاد آنها نیز بروز یافته است . در معیار Ds بیشترین فاصله بین اکوتیپ کلول از نژاد سنجابی و کردي خراسان - 0/5376 - و نیز بین اکوتیپ کژال از نژاد سنجابی و کردي خراسان - - 0/5222 می باشد . دلیل این امر ممکن است فاصله زیاد جغرافیائی بین این دو نژاد باشد. زیرا امکان تبادل ژنتیکی طبیعی نژاد سنجابی با کردي خراسان میسر نمی باشد. بنابر این انتظار می رفت که در یک سوي فواصل، جمعیت کردي خراسان قرار گیرد .
فاصله بین دو نژاد کردي و سنجابی در معیار Ds، 0/3409 محاسبه شده است. نتایج این مطالعه با نتایج بنابازي - 1381 - که با استفاده از پنج جایگاه ریز ماهواره بر روي همین نژاد به دست آورده است - 1 - ، مطابقت گردید. در این مطالعه کمترین فاصله ژنتیکی بین این دو جمعیت، مربوط به جمعیتهاي سنجابی و کردي کردستان - 0/180 - و بیشترین فاصله بین نژاد سنجابی و نژاد کردي خراسان - - 0/450 گزارش شده.
شکل 1- فیلوژنی حاصل از معیار فاصله ژنتیکی Ds - نی، - 1978 که با استفاده از روش UPGMA ترسیم گردیده است را نشان می دهد . درخت UPGMA حاصل از معیار Ds ، موضع شناسی متفاوتی در مقایسه با بقیه فیلوژنی ها دارا می باشد . در این درخت دو شاخه مجزا مشاهده می گردد شاخه اول مربوط به نژاد سنجابی می باشد که در این شاخه دو اکوتیپ کژال و کلول در یک زیر شاخه و اکوتیپ زردي نیز در زیر شاخه دیگر قرار گرفته است.
در شاخه دوم UPGMA اکوتیپ هاي مربوط به نژاد کردي قرار دارند که اکوتیپ کوهستان و دشت به دلیل اینکه هر دو در استان کردستان هستند در یک زیر شاخه قرار دارند و اکوتیپ کردي خراسان به علت موقعیت دور جغرافیائی نسبت به دو اکوتیپ دیگر در یک زیر شاخه مجزا قرار گرفته است.
علی رغم آنکه این درخت به خوبی با شباهت هاي فنوتیپی ، وضعیت جغرافیائی مناطق پراکنش جمعیتهاي مورد بررسی و هم منشاء بودن دو اکوتیپ - دشت و کوهستان - کردي انطباق دارد، فیلوژنی که بنا بازي - - 1381 با معیار فاصله ژنتیکی Ds و درخت UPGMA در دو جمعیت کردي و سنجابی گزارش نموده است تا حدودي متفاوت می باشد. به طوري که در آن مطالعه نژادهاي کردي و سنجابی در یک شاخه و کردي خراسان در شاخه دیگر در همان خوشه قرار گرفته است.
با مطالعه حاضر مشخص گردید که ریز ماهواره هاي مورد مطالعه شرایط مناسب را براي استفاده در مطالعات آینده - آنالیز پیوسته و مطالعات نسبی شجره - دارا بوده و از چند شکلی بالا برخوردار هستند .با توجه به اینکه برخی ریز ماهواره هاي مورد مطالعه در مطالعات قبلی داراي چند شکلی نسبتاً پائین بودند ولی در حال حاضر چند شکلی بالا نشان داده اند، لذا پیشنهاد می شود که ریز ماهواره هاي دیگري نیز در سطح ژنوم این گوسفندان مورد مطالعه و بررسی قرار گیرد.
تهیه نقشه هائی از این گوسفندان با تراکم بالا از ریز ماهواره هاي چند شکل، مطالعات بعدي را بر روي این نوع گوسفندان با استفاده از اطلاعات شجره اي بهبود خواهد بخشید .
جدول 1- ماتریس فواصل ژنتیکی Ds براي اکوتیپ هاي مختلف گوسفندان کردي و سنجابی
