بخشی از مقاله
چکیده:
بیماري پیچیدگی برگ چغندرقند توسط چندین جمینی ویروس متفاوت ایجاد می گردد که یکی از آنها ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندر قند - BCTIV - 1 است . این ویروس براي اولین بار در سال 1385 از ایران گزارش گردید. تعیین هویت جمینی ویروس ها بدلیل اندازه کوچک ژنوم با اثبات بیماریزا بودن آنها یعنی اجراي اصول کخ انجام می شود. با وجودیکه بسیاري از ویژگی هاي بیولوژیکی و مولکولی ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندر قند مورد مطالعه قرار گرفته است، هنوز بیماریزائی آن اثبات نشده است.
در تحقیق حاضر، با توجه به اهمیت بیماري پیچیدگی برگ چغندرقند در ایران و به منظور اثبات بیماریزائی ژنوم تک بخشی آن، اقدام به ساخت همسانه آلوده کننده2 گردید. در مرحله اول، دو طول کامل ژنوم BCTIV بصورت نسخه دوتایی کامل3 داخل ناقل دوگانه pGreen قرار داده شد. این سازه با روش انجماد و ذوب به سلول هاي آگروباکتریوم نژاد C58 منتقل و سپس به تعدادي گیاه تزریق گردید. در طی 6-8 هفته عکس العمل گیاهان تلقیح شده توسط سازه عفونت زاي BCTIV مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج بدست آمده نشان داد، چغندر قند توسط این سازه آلوده شده و علائم مشخص بیماري پیچیدگی برگ چغندر در آن ایجاد می گردد. آلودگی یا عدم آلودگی گیاهان توسط آزمون PCR تائید گردید . بر اساس نتایج این تحقیق، ماهیت BCTIV به عنوان یک جمینی ویروس متفاوت با ژنوم تک بخشی اثبات گردید. سازه ساخته شده می تواند در آینده براي بسیاري از مطالعات از جمله تعیین وظایف ژنها و شناسائی یا تولید واریته هاي مقاوم مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه:
در سال 1384 ویروس جدیدي از مزارع چغندر قند کرمان تحت عنوان ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندر قند گزارش گردید. مطالعات صورت گرفته طی چند سال اخیر نشان می دهد ویروس عامل پیچیدگی برگ چغندرقند در ایران ویروسی متفاوت با سایر گونه هاي کورتو ویروس می باشد . - 5 - در جمینی ویروس ها، تعیین هویت ویروس با اثبات بیماري زا بودن آن انجام می شود. اجراي اصول کخ در جهت اثبات بیماري زا بودن جمینی ویروس ها امري عادي است.
براي اثبات بیماري زایی، لازم است یک همسانه آلوده کننده تولید شود. روشی که کارآیی زیادي براي تولید همسانه آلوده کننده در جمینی ویروس ها دارد استفاده از تلقیح ویروس به کمک آگروباکتریوم است. در این روش ژنوم کامل جمینی ویروس به صورت یک نسخه دوتایی ناقص 14، نسخه دوتایی کامل5 و یا نسخه هاي چندتایی6در داخل یک ناقل مخصوص به نام ناقل دوگانه قرار داده می شوند.
سپس این سازه به نژاد خاصی از آگروباکتریوم منتقل و به منطقه ویژه اي در گیاهچه یا درون دانه ي میزبان اختصاصی تلقیح می شود. این روش همچنین به محققین اجازه می دهد تا موتاسیون هایی در ژنوم ویروس ایجاد کنند و تقابل بین میزبان و ویروس را در مقایسه با ژنوم موتانت نشده مورد بررسی قرار دهند . - 3 - با توجه به اهمیت بیماري پیچیدگی چغندرقند در ایران و به منظور اثبات اصول کخ، ساخت همسانه آلوده کننده براي این ویروس ضروري به نظر می رسد.
مواد و روش ها:
-1 منبع و تکثیر ویروس
منبع اولیه ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندر قند براي ساخت همسانه عفونت زا، بوته چغندر قند آلوده اي بود که در سال 1387 از مزارع چغندر قند نگار 56 - کیلومتري جنوب کرمان - جمع آوري شده بود. تکثیر طول کامل ژنوم ویروس با استفاده از کیت TempliPhi - Amersham Biosciences, USA - و بر اساس روش - 7 - صورت گرفت. در این روش، ژنوم ویروس بصورت یک پلی مر خطی شامل مجموعه اي از چندین طول کامل ژنوم، تکثیر گردید. این پلی مر خطی، توسط آنزیم برشی PstI بریده شده و درون پلاسمید pGEM3zf - + - قرار داده شد. پلاسمید نوترکیب حاصل، pGEM 2.84 نامیده شد و به باکتري Escherichia coli نژاد JM107 منتقل گردید.
-2 طرز ساخت همسانه عفونت زاي دوتایی
در این سازه دو طول کامل ژنوم به دنبال یکدیگر قرار داده شدند. به منظور جدا شدن طول کامل ژنوم و پلاسمید pGEM3zf - + - از یکدیگر هضم آنزیمی پلاسمید نوترکیب pGEM 2.84 با آنزیم PstΙ انجام گرفت و خالص سازي پلاسمید نوترکیب بریده شده - pGEM2.84 - با استفاده از کیت Pure PCR Product Purification kit - Roche, High Germany - انجام شد. غلظت نمونه با دستگاه اسپکتوفتومتر سنجیده شد. جهت قرار دادن طول کامل ژنوم ویروس درون ناقل دوتائی pGreen، ناقل فوق نیز می بایست با آنزیم مورد استفاده براي آماده سازي طول کامل ژنوم ویروس، بریده شود تا از طریق جایگاههاي برش به یکدیگر متصل گردند.
هضم آنزیمی ناقل دوتائی pGreen با آنزیم برشی PstI انجام و گروه فسفر در دو انتهاي 5´ و3´ بازوهاي ناقل دوگانه حذف گردید، خالص سازي مخلوط حاصل با استفاده از کیت Pure High PCR Product Purification kit - Roche, Germany - انجام و غلظت نمونه با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر تعیین گردید. قرار دادن طول کامل ژنوم ویروس داخل ناقل دوتائی pGreen با کمک آنزیم T4 DNA Ligase - Takara, Japan - انجام پذیرفت و پلاسمید نوترکیب حاصل pGreen 2.84 نامیده شد .
سپس پلاسمید نوترکیب pGreen 2.84 به داخل باکتري E. coli انتقال داده شد. پرگنه هاي سفید با آزمون PCR سنجیده شدند و براي اطمینان بیشتر از انجام عمل همسانه سازي، عمل هضم آنزیمی روي آنها انجام گرفت. جدا شدن قطعه Insert از پلاسمید بعد از عمل هضم آنزیمی بیانگر انجام همسانه سازي می باشد. عمل هضم آنزیمی ناقص با هدف بریده شدن یک جایگاه از دو جایگاه آنزیم برشی PstI روي پلاسمید pGreen 2.84 توسط یک میکرولیتر آنزیم PstI - 10U/µl - در مدت زمان کوتاه، انجام شد سپس عمل حذف گروه فسفر صورت گرفت و غلظت محلول با استفاده از اسپکتروفتومتر تعیین گشت. یک طول کامل دیگر ژنوم ویروس داخل pGreen 2.84 قرار داده شد و پلاسمید نوترکیب pGreen 5.68 به دست آمد .
پلاسمید نوترکیب به باکتري E. coli منتقل شد و با آنزیم هاي گوناگون براي اطمینان از درستی همانندسازي آزمایش شد. پلاسمید نوترکیب pGreen 5.68 - حاوي دو طول کامل ژنوم - به آگروباکتریوم نژاد C58 با استفاده از روش انجماد/ذوب وارد شد. پرگنه هاي حاوي پلاسمید نوترکیب انتخاب و نگهداري شدند. مخلوط آگروباکتریوم حاوي پلاسمید نوترکیب pGreen 5.68 به گیاه تزریق شدو علائم ویروس روي گیاه بررسی گردید. استخراج ویروس از گیاه مورد آزمایش با روش CTAB انجام شد و از آزمون PCR با آغازگرهاي اختصاصی جهت اطمینان از آلوده شدن گیاه استفاده گردید.
نتایج و بحث
بیماري پیچیدگی برگ چغندرقند یکی از مخرب ترین بیماري هاي ویروسی چغندر در ایران و جهان است . - 1 - تاکنون ویروس هاي مختلفی بعنوان عامل این بیماري گزارش شده اند . - 5 ; 6 - بر اساس مطالعات قبلی دو ویروس پیچیدگی شدید برگ چغندر قند و ویروس ایرانی پیچیدگی برگ چغندر قند به عنوان عامل این بیماري در ایران معرفی شده اند. اما به نظر می رسد که BCTIV عامل اصلی بیماري پیچیدگی برگ چغندر قند در ایران است . - 2 ; 5 - تعیین هویت جمینی ویروس ها، با اثبات بیماریزا بودن آنها انجام می شود. براي اثبات بیماریزایی، لازم است یک همسانه عفونت زا ساخته شود. در سازه دوتایی، دو طول کامل ژنوم به دنبال یکدیگر قرار داده شدند.
براي ساخت این سازه، قطعه مورد نظر که با آنزیم محدود کننده PstI از ناقل pGEM3zf - + - جدا شده بود مستقیما در ناقل دو گانه pGreen همسانه سازي شد. استفاده از غلظت پایین آنزیم برشی و کاهش مدت زمانی که دي.ان . اي هدف در معرض این آنزیم قرار می گیرد، از روش هاي جدیدي است که اخیرا براي قرار دادن چند واحد ژنوم درون ناقل دوگانه مورد استفاده قرار می گیرد . - 4 - صحت قرار گرفتن دو طول کامل ژنوم درون ناقل دو گانه با آنزیم هاي برشی متفاوت سنجیده شد.
