بخشی از مقاله
خلاصه
تشخیص دقیق جنس نوزاد در گونه هاي اهلی به ویژه در صنعت دام داراي کاربردهاي تجاري و پژوهشی اساسی می باشد. در استفاده از سونوگرافی علاوه براینکه احتمال خطر براي اپراتور و مادیان وجود دارد ، نیازمند تجهیزات تخصصی و متخصص می باشد.. در سالهاي اخیر، واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - براي تکثیر توالیهاي DNA اختصاصی کروموزوم Y - ژن - SRY براي تعیین جنسیت حیوانات مختلف استفاده شده است. تعیین جنسیت مولکولی،بر اساس واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - می تواند ، عملیجایگزین، با ارائه نتایج حساس، دقیق، سریع و قابل اعتماد باشد.
بررسی نتایج
تشخیص دقیق جنس نوزاد در گونه هاي اهلی به ویژه در صنعت دام - 3، - 2،داراي کاربردهاي تجاري و پژوهشی اساسی - Peippo et al.,1995 - ، می باشد - Han et al ., 2010 ،. - Buccart al., 2005 به طور سنتی،تعیین جنسیت جنین در مادیان معمولا بر اساسشناسایی محل برجستگی تناسلی با استفاده از سونوگرافی ترانس رکتال در روز59 الی 68 بارداري امکان پذیر می باشد. علاوه بر این، در روز 210 - 120 بارداري مادیان می توان جنسین جنین را از طریق شناسایی دستگاه تناسلی خارجی جنین، توسط تصویربرداري سونوگرافی ترانس رکتال و شکمی تشخیص داد.. ولی در این تکنیک علاوه براینکه احتمال خطر براي اپراتور و مادیان وجود دارد ، نیازمند تجهیزات تخصصی و متخصص می باشد.
تعیین جنسیت مولکولی،بر اساس واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - می تواند ، عملیجایگزین، با ارائه نتایج سریع، حساس، دقیق و قابل اعتماد باشد - Han et al ., 2010 - امروزه تولیدات دامی بویژه در حیوانات داراي ارزش زیاد، بستگی زیادي به پیشرفت علم در زمینه تکنولوژیهاي تولید مثل دارد. تعیین جنسیت با استفاده از نمونه هاي مختلف اغلب یک ابزار مهم در علم باستان شناسی یا تعیین ژنوتیپ حیوانات می باشد . - Dervishi et al., 2008 -
در طول بارداري، گردش خون مادر و جنین توسط پرده هاي جفتی از هم جدا بوده ولی با این حال، DNA حاصل از لیز سلولهاي بافت جنینی به علت آسیب هاي فیزیکی ، ایمنی و آپوپتوز تکاملی از پرده هاي جفت عبور می کنند - Lo et al., - 1997 در دوران بارداري زنان ، به طور متوسط 10 درصد از DNA موجود در پلاسما ازسلول هاي جنین مشتق می شود - Lun et al.,2008 - در نتیجه تعیین جنسیت جنین با استفاده از تکثیر DNA و تشخیص توالی هاي کروموزومY در پلاسماي RFLP ژنهاي ZFX/ZFY براي تعیین جنسیت در گاو و گوسفند مورد مادر امکان پذیر می باشد.
در حال حاضر اکثر روشهاي تعیین ژنوتیپ جنسی از کروموزوم Y در نرها استفاده می کنند. کشف مقادیر زیاد اسید نوکلئیک جنین در گردش خون مادر پنجره جدیدي از تحقیقات را بر روي محققین باز کرد و یک امید جدیدي را براي تشخیص مولکولی قبل از زایمان ایجاد کرد . - Lo et al., 1997 - جدا کردن DNA آزاد جنینی از سرم مادر براي تعیین جنسیت جنین و غربال جنین براي مشکلات و بیماریهاي مرتبط با آبستنی مفید بوده است . - Bianchi and Lo, 2001; Lo, 2001 - همچنین از این تکنیک می توان براي تحقیق در مورد رشد و نمو و مسائل مربوط به انتقال مواد و سلولها از مادر به جنین، حفظ جنین در بدن مادر به عنوان آلوگرافت و تولید مقاومت نسبت به آن و بیماریهاي خود ایمن مادر مثل اسکلرودرما استفاده کرد.
روشهاي دیگري نیز براي تعیین جنسیت جنین مثل تشخیص آنتی ژن H-Y، سلول شناسی، اندازه گیري آنزیمهاي وابسته به کروموزوم X قبل از تشکیل اجسام Barr، پروبهاي ویژه کروموزوم Y و FISH استفاده می شود. از آنجائیکه قابلیت اتکاء و اطمینان به آزمایش در تعیین جنسیت خیلی مهم است روش واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - یکی از روشهاي قابل اطمینان در این مورد بوده و سریع، ارزان با حساسیت خیلی بالا می باشد . - Dervishi et al., 2008 - در سالهاي اخیر، واکنش زنجیره اي پلیمراز - PCR - براي تکثیر توالیهاي DNA اختصاصی کروموزوم Y - ژن - SRY براي تعیین جنسیت حیوانات مختلف استفاده شده است.
- Bondioli , 1992; Griffitts et al., 1993 - با وجود این، عدم تکثیر این ژن الزاما به معنی ماده بودن جنس جنین نمی باشد، چون جواب منفی غلط می تواند منجر به تعیین غلط جنیست شود. براي حل این مشکل از یک ژنی که در هر دو جنس نر و ماده وجود دارد در یک آزمایش واحد استفاده می شود. در همین جهت تکثیر ناحیه ZFX/Y و انجام RFLP متعاقب آن صورت گرفته است ولی چون RFLP نیاز به یک واکنش دیگر دارد و احتمال آلودگی و جواب غلط را بالا می برد خیلی از محققین از آن استفاده نمی کنند.
روشهاي دیگري که شامل PCR دوپلکس و تکثیر همزمان توالی اختصاصی کروموزوم Y و یک توالی اتوزوم به عنوان کنترل - هم براي حضور DNA و هم براي شرایط تکثیر - می باشد استفاده می شوند که نیارمند هزینه زیاد می باشد. ژن amelogenin در کروموزوم هاي جنسی قرار دارد. بین amelogenin وابسته به کروموزوم X و amelogenin وابیسته به کروموزم Y، شش جفت باز تفاوت وجود دارد که با توجه به این تفاوت می توان از این ژن در تشخیص جنسیت جنین قبل از تولد استفاده نمود. . - Mannucci et al., 1994 -
بحث
در مطالعات مختلفی، در نشخوارکنندگان تکثیر و آنالیز استفاده قرار گرفته است . - Kochhar et al., 2000 - Jimenez &Tarantal در سال 2003 با استفاده از Real-time PCR توانستند توالی اختصاصی کروموزوم - Y - SRY جنسیت جنین نر میمون ریسوس را تا روز 50 آبستنی تشخیص دهند. همچنین آنها مقادیر DNA جنینی در سرم مادر را 341 ژنوم در میلی لیتر تعیین کردند که قابل مقایسه با مقادیر انسانی بود. همانند انسان، چهار هفته بعد از زایمان هیچ توالی جنینی در سرم مادر تشخیص داده نشده است.
ژن - AMEL - amelogenin که در هر دو کروموزوم X - AMELX - و Y - AMELY - وجود دارد براي تعیین جنسیت جنین گاو - - Ennis et al ., 1994، گوسفند و گوزن - Pfeiffer and Brenig, 2005 - و سایر نشخوارکنندگان - Weikard et al., 2006 - استفاده شده است. در همین راستا، - Pfeiffer and Brenig 2005 - یک حذف 45 جفت بازي را در ژن amelogenin در کروموزوم Y گزارش کردند. در این گزارش ماده ها تنها یک باند 265 جفت بازي و نرها دو باند 263 و 218 جفت بازي را تولید کردند.
- Pomp et al 2012 - توانستند با استفاده از تکثیر ژنهاي SRY - sex-determination region Y - و ژن Zfy - نرها - و ژن Zfx - ماده ها - به عنوان کنترل مثبت واکنش PCR تعیین جنسیت را بر روي بسیاري از حیوانات از جمله در خوك، گاو، گوسفند، بز، اسب، سگ و گربه انجام دهند. - Prashan et al 2008 - نیز توانستند با استفاده از Duplex PCR یک تکنیک ساده مبتنی بر PCR براي تکثیر ژنهاي SRY - ژن موجود فقط بر روي کروموزم جنسی - Y و GAPDH - ژن اتوزومی - طراحی کنند که بتواند به طور ساده در گاوسانان تعیین جنسیت کند.
- Cruz et al 2012 - براي تعیین جنسیت جنین هاي گاو، نمونه هاي خون پلاسماي 35 گاو آبستن را در هفته هاي مختلف آبستنی - از 5 تا 35 هفته - با استفاده ازیک برنامه multiplex-PCR و تکثیر 210 جفت باز از کروموزوم Y و 280 جفت باز از کروموزم یک انجام دادند. نتایج مطالعات آنها نشان داد که سن آبستنی تاثیر معنی داري بر روي تعیین جنسیت دارد. چنانچه در روزهاي 43 ، 48 و 55 آبستنی دقت تشخیص جنسیت به ترتیب 95، 99 و 99.9 درصد بوده است.
- Hasegawa et al 2000 - ژنهاي SYR و AMELX را برروي اسب هاي نر و مادیان و همچنین اسب هاي به ظاهر ماده را که از نظر سیتوژنتیکی حاوي هر دو کرموزوم X و - XY-mare - Y بودند را با روش PCR بررسی کردند. آنها به این نتیجه رسیدند که با تکثیر ژنهاي فوق الذکر با استفاده از تکنیک مبتنی بر PCR می توان پی به وجود کرموزوم Y در نرها و همچنین در XY-mare برد. نتایج موجود نشان می دهد استفاده از PCR براي تشخیص جنسیت جنین روشی مناسب و کارامد می باشد.
