بخشی از مقاله
چکیده
در این پژوهش توانایی باززایی گیاه از کالوسهاي بدست آمده از گره هاي گیاه تک لپه آلسترومریا رقم فیگو مورد مطالعه قرار گرفت. حداکثر کالوسهاي جنینی توده اي در محیط کشت SH حاوي 2 میلی گرم در لیتر پیکلرام بدست آمد. 3 ماه پس از کشت جهت پرآوري، کالوسها به محیط کشت MS تغییر داده شده حاوي 5 میلی گرم در لیتر پیکلرام منتقل گردیدند. جنین زایی سوماتیکی و باززایی گیاه از این جنین ها، پس از انتقال کالوسهاي جنینی توده اي به محیط کشت باززایی حاوي غلظت هاي مختلف BAP صورت گرفت. بیشترین گیاهچه از محیط کشت MS حاوي 0/5 میلی گرم در لیتر BAP بدست آمد. کل زمان مورد نیاز جهت باززایی گیاه کامل تقریباً 8 ماه بطول انجامید.
مقدمه
آلسترومریا - از خانواده آلسترومریا - یکی از مهمترین گونه هاي زینتی دنیا می باشد که جهت تولید گلهاي شاخه بریده کشت و کار می شود - . - 7 در گیاهان، وجود یک سیستم باززایی کارآمد به منظور اصلاح و انتقال ژن ضروري می باشد که علاوه بر این می توان جهت تکثیر گیاهان نیز استفاده نمود - . - 5 ثابت شده است که در گیاهان تک لپه، کالوسهاي جنینی بهترین بافت هدف جهت انتقال ژن می باشد - . - 8 بنابراین در این تحقیق تشکیل کالوسهاي جنینی و باززایی گیاه از جنین هاي سوماتیکی در گل آلسترومریا مورد بررسی قرار گرفت.
در این گیاه جنین زایی سوماتیکی از طریق کشت جنینهاي زیگوتی بالغ و نابالغ، تخمک، تخمدان و قطعات ساقه حاصل از نشاء ها، صورت گرفته است 1 - ، 2، 3، 4، 6، . - 9 اما از آنجایی که گیاه آلسترومریا کاملاً هتروزیگوت می باشد از کالوسهاي حاصل از جنین هاي زیگوتی و بافت هاي نشاء ها نمی توان جهت انتقال ژن استفاده نمود - . - 5 بنابراین در این تحقیق براي نخستین بار از گیاهانی که به صورت رویشی تکثیر شده بودند جهت تهیه ریزنمونه استفاده گردیدند.
مواد و روشها
در این تحقیق از ساقه هاي جوان آلسترومریا به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید. قطعات ساقه پس از گندزدایی 20 - دقیقه در هیپوکلویت 3 - %1/5 بار با آب مقطر استریل آبکشی شدند. سپس گره ها به ضخامت 1-2 میلی متر از قطعات ساقه برش داده شدند و ابتدا به مدت 10 روز در محیط کشت MS حاوي 2/2 میلی گرم در لیتر TDZ و 0/1 میلی گرم در لیتر IBA، 30 گرم در لیتر ساکارز و 2/5 گرم در لیتر ژلرایت کشت گردیدند و سپس به محیط کشت SH حاوي 2 میلی گرم در لیتر 2,4-D یا پیکلرام همراه یا بدون 0/5 میلی گرم در لیتر BAP منتقل شدند و هر 3 هفته یکبار واکشت شدند.
3 ماه پس از کشت در محیط SH ، گره هاي حاوي کالوس جهت پرآوري به محیط کشت MS تغییر داده شده حاوي 5 میلی گرم در لیتر پیکلرام منتقل شدند و هر 4 هفته یکبار به مدت 2 ماه واکشت شدند. جهت باززایی، کالوسهاي توده اي به قطعات 5-7 میلی متر تقسیم شدند و به تعداد 12 عدد در هر پتري حاوي محیط کشت باززایی کشت گردیدند و هر 2 هفته یکبار واکشت شدند. محیط کشت باززایی شامل محیط کشت MS حاوي 30 گرم در لیتر ساکارز، 6 گرم در لیتر فیتاآگار و 5 تیمار هورمونی 0، 0/1، 0/5، 1 و 2 میلی گرم در لیتر BAP بود.
پس از تشکیل جنین هاي سوماتیکی جهت باززایی گیاهچه، جنین ها در همان محیط قبلی واکشت شدند. کالوس زایی و پرآوري کالوسها در تاریکی و دماي 24œc و جنین زایی سوماتیکی از کالوسها و باززایی گیاهچه در روشنایی و با فتوپریود 16 ساعت و دماي 24œc انجام گردید. این آزمایش بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملا تصادفی با 3 تکرار انجام شد. تجزیه و تحلیل آماري داده ها توسط نرم افزارSPSS، SAS وExcel صورت گرفت و مقایسه میانگین ها به روش دانکن انجام شد.
نتایج و بحث
در این آزمایش 2 نوع کالوس کروي و توده اي مشاهده گردید. کالوسهاي کروي یک هفته پس از کشت تشکیل شدند. این نوع کالوسها، کالوسهایی آبدار و غیرجنینی بودند که پس از انتقال به محیط کشت باززایی قهوه اي رنگ شدند و از بین رفتند. کالوسهاي توده اي یک ماه پس از کشت تشکیل شدند. این نوع کالوسها داراي شکل نامنظم و به رنگ زرد و یا سفید بودند. %17 از گره ها در محیط کشت حاوي پیکلرام تشکیل کالوسهاي توده اي دادند که بسیار چشمگیر از محیط کشت حاوي - %4 - 2,4-D بود.
تاکنون اکسین هاي 2,4-D و NAA بیشترین کاربرد را در جنین زایی سوماتیکی آلسترومریا داشته اند 1 - ، 2، 3، 4، 5، 6، - 9 اما در این تحقیق بالاترین درصد کالوسهاي جنینی - %23 - در محیط کشت حاوي 2 میلی گرم در لیتر پیکلرام بدست آمد که این می تواند به دلیل فعالیت بیولوژیکی ضعیف تر پیکلرام نسبت به NAA و 2,4-D باشد که باعث ایجاد مناسب ترین توازن اکسینی جهت تشکیل کالوسهاي جنینی می شود . - 10 - افزودن BAP به محیط کشت حاوي 2,4-D باعث اندکی افزایش در تشکیل کالوسهاي توده اي می شود در حالیکه افزودن BAP به محیط کشت حاوي پیکلرام باعث کاهش تشکیل کالوسهاي توده اي می شود که مغایر با گزارش کیم و همکارانش - 2006 - مبنی بر اثر افزاینده BAP در محیط حاوي پیکلرام در تشکیل کالوسهاي توده اي می باشد.
پس از انتقال ریز نمونه ها به محیط کشت پرآوري، کالوس هاي توده اي، تشکیل کالوس هاي توده اي جدیدي نمودند اما تغییري در کالوس هاي کروي مشاهده نگردید. در محیط کشت باززایی، جنین هاي سوماتیکی تنها از کالوسهاي توده اي زرد رنگ بدست آمدند. 2 هفته پس از کشت، در تمامی محیط کشت هاي باززایی، پیش جنین ها بر روي سطح کالوسهاي توده اي تشکیل شدند. تعداد جنین هاي سوماتیکی در هر محیط کشت رنجی از 28 تا 41 عدد بود؛ با این حال اختلاف معنی داري در بین محیط کشت هاي باززایی مشاهده نگردید. همچنین بیشترین تعداد گیاهچه باززایی شده از جنین هاي سوماتیکی - %66/5 - در محیط کشت MS حاوي 0/5 میلی گرم در لیتر BAP بدست آمد. سپس گیاهچه هاي حاصل جهت سازگاري به گلدانهاي حاوي پیت و ورمی کولایت - 2 :1 - منتقل شدند. کل زمان مورد نیاز جهت تولید یک گیاه کامل از طریق جنین زایی سوماتیکی در این تحقیق 8 ماه بود.
