بخشی از مقاله
چکیده:
پروتئین ADAM27 یکی از پروتئینهاي سطح غشا، پلاسمایی اسپرم است. حدس زده میشود این پروتئین در اتصال اسپرم به تخمک و در نتیجه فرایند لقاح نقش داشته باشد. ایجاد لاین موشی که داراي ژن ناقص ADAM27 باشد، میتواند به منظور برسی تاًثیر این پروتئین درفرایند لقاح نقش کلیديداشته باشد. سلولهاي بنیادي جنینی موشی - - ESCs را که یک نسخه از ژن ADAM27 آنها بوسیلهي نوترکیبی هومولوگ از کار افتاده بود، براي ایجاد موشهاي کایمر استفاده شدند. براي این منظورسلولهاي ES روي لایهاي از سلولهاي MEF غیرفعال شده ودر حضور LIF کشت شدند. در روز دوم پاساژ، کلونهاي ES بوسیلهي تریپسین به حالت منفرد درآمدند. این ESها به درون حفرهي بلاستوسیست میزبان توسط میکرومنی پولیتور - Micromanipulator - تزریق شدند.
براي بدست آوردن بلاستوسیستهاي میزبان، موشهاي مادهي نژاد NMRI براي تخمک گذاري بیشتر تحریک شده با موشهاي نر همان نژاد جفت انداخته شدند. فرداي جفت اندازي موشهاي مادهي داراي پلاك واژینال - روز - 0.5 جداسازي شدند. روز 3.5 رحم موشهاي ماده برداشت شده و با Flushing بلاستوسیستها استخراج شدند. به هر بلاستوسیست 6 الی 16 سلول داراي ژن ناقص ADAM27 تزریق شد. 8 الی 16 جنین به رحم هر موش مادهي Foster - روز - 2.5 باعمل جراحی منتقل شدند.موشهاي Foster حاصل آمیزش موشهاي ماده با نرهاي وازکتومی شده هستند. تعداد 138 جنین منتقل شدند که از این تعداد47 نوزاد به دنیا آمدند. 13 نوزاد از آنها درجات مختلفی - تا70 درصد - از کایمریسم را نشان دادند. کایمرها بوسیلهي رنگ تیرهي پوست سلولهاي ES که داراي ژن ناقص ADAM27 بودند - بلاستوسیستهاي میزبان آلبینو بودند - تشخیص داده شدند.
کلمات کلیدي: سلولهاي بنیادي جنینی، کایمر، بلاستوسیست
مقدمه
حیوانات تراریخت امکانات جدیدي در زیست فناوري ایجاد کرده اند. حیوانات تراریخت امکان ایجاد مدلهایی براي بیماريهاي مختلف ژنتیکی را فراهم میکنند. این مدلها هم منجر به شناخت دقیق مکانیسم بیماریها می شوند و هم اجازه میدهند که روشهاي مختلف درمانی قبل از بکار بردن در بدن انسان روي آنها آزمایش و میزان کارایی آنها بررسی شود - . - 1 حیوانات نوترکیب ابزارهاي قدرتمندي براي مطالعهي نقش و عملکرد ژنها و برسی بیان ژنها در شرایط زنده - in vivo - هستند . - 2 - با استفاده ازاین فناوري میتوان بیان یک ژن را در بدن بالا برد ویا بیان آن راسرکوب کرد، تکنیک هاي جدیدتر مثل سیستم هاي تحریک پذیر که اجازهي بیان قابل کنترل ژن را میدهند - - 3 - مانند تتراسیکلین ایندیوسیبل سیستم - و سازه هاي siRNA که امکانات جدیدي جهت بررسی بیان ژن در اختیار میگذارند که هم درك ما را از حیات کاملتر میکنند هم ما را در شناخت بیشتر بسیاري از بیماریها که به دلیل تغییر دربیان ژنها ایجاد میشوند، کمک میکنند.
علاوه برموارد ذکرشده دستکاري ژنتیکی حیوانات میتواند منجربه دستیابی به حیوانات اهلی با کارایی بهتر، محصولات بیشتر ویا مقاوم به بیماري بشود. همچنین امکان استفاده از این حیوانات تغییریافته براي تولید پروتیینهاي نوترکیب دارویی و جایگزینی بافتهاي آسیب دیدهي انسانی وجود دارد. براي بسیاري از اهداف - مانند موشهاي مدل بیماریهاي ژنتیکی، موشهاي - Knock-out ، اعمال تغییرات ژنتیکی نیازمند استفاده از سلولهاي بنیادي جنینی است. براي تراریختگی با واسطهي ESCs، دو تکنیک ریزتزریقی ESCs به حفرهي بلاستوسیست و Morula Aggregation رایج هستند. ولی تکنیک نخست بسیار بیشتر مورد استفاده قرار گرفته است.به منظور تولید موشهاي کایمر داراي ژن ناقص ADAM27، سلولهاي بنیادي جنینی که یکی از آللهاي ژن ADAM27 آنها توسط نوترکیبی هومولوگ از کار افتاده بود، توسط تکنیک ریزتزریقی بع داخل بلاستوسیست تزریق شد. بلاستوسیستهاي دستکاري شده به رحم موشهاي مادهي Foster - 2.5 - انتقال داده شدند. پس از پایان دورهي بارداري نوزادان کایمر به دنیا آمدند.
مواد و روشها
موشها: موشهاي مورد استفاده از نژاد NMRI از انستیتو پاستور ایران تهیه شدند. موشهاي ماده براي تخمکگذاري بیشتر بوسیله ي هورمون تحریک شدند. 8 U هورمون PMSG در ساعت 13 به صورت داخل صفاقی تزریق و 47 ساعت بعد 8 U هورمون hCG تزریق و بلافاصله با موشهاي نر جفتاندازي شد. صبح روز بعد موشها از نظر پلاك واژینال بررسی شدند موشهاي داراي پلاك واژینال - 0/5روزه - جدا شده در روز 3/5 براي برداشت بلاستوسیست مورد استفاده قرار گرفتند. براي به دست آوردن موشهاي Foster، موشهاي ماده به شکل مشابهی تیمار شدند ولی به جاي موشهاي نر طبیعی با موشهاي نر وازکتومیشده جفت اندازي شدند.
وازکتومی کردن موشهاي نر: موشهاي نر 8-6 هفتهاي وزن شده توسط داروي ترکیبی کتامین-زایلوزین بیهوش شدند. یک شکاف به طول تقریبی 1 سانتیمتر در راستاي خط میانی شکم 1 سانتی متر بالاتر از پنیس ایجاد شد. یک شکاف کوچکتر در پوشش داخلی ایجاد کرده از طریق بافت چربی اطراف بیضه، بوسیلهي یک پنس ظریف بیضه بیرون کشیده شد. لولهي وازدفران توسط پنس صاف بالا کشیده شد تا از بیضه فاصله بگیرد. پنس دوم روي شعله داغ شد سپس لولهي اپیدیدیم از دو مکان به شکل نیم حلقه توسط حرارت پنس قطع شد. این کار براي هردو بیضه تکرار گردید. بیضهها به داخل بدن برگردانده شدند. شکاف با 2-3 بخیه بسته شد.
برداشت بلاستوسیستها از رحم: موشهاي مادهي باردار 3/5 روزه با بیهوشی عمیق توسط کلروفرم کشته شدند. شکم موش باز شد بوسیله دو پنس چربیهاي اطراف رحم جذا شدند. با قیچی مناسب ابتداي رحم نزدیک اویداکت بریده شد. برش دیگر درانتهاي رحم نزدیک سرویکس زده شد. رحم به یک پلیت کشت سلول 3 سانتیمتري حاوي محیط M2 منتقل شد. بوسیله سرنگ انسولین از انتهاي رحم محیط M2 به داخل رحم تزریق شد تا جنینها از ابتداي رحم خارج شوند. بلاستوسیستها زیر میکروسکوپ تشریح توسط پیپت دهنی متصل به پیپت پاستور پیپت - پاستور قبلاً با کمک شعله کشیدهمیشود تا قطر مناسب براي کار با جنین به دست آید. همچنین فعالیت موئینگی آن توسط چند تکرار حباب هوا محیط کشت مهار میشود - برداشت شده به قطرههاي محیط M16 - روي قطرهها با روغن معدنی پوشیده میشود تا از تبخیر سطحی جلوگیري به عمل آید - منتقل تا زمان تزریق بلاستوسیست به انکوباتور منتقل شدند.
کشت سلولهاي بنیادي جنینی: سلولهاي بنیادي جنینی داراي آلل ناقص ژن ADAM27 با هم کشتی روي لایهاي از سلولهاي MEF - در پاساژ - 3-1 کشت شدند. سلولهاي MEF از طریق اتصالات سلولی و نیز فاکتورهایی که ترشح میکنند براي حفظ پرتوانی ESCs لازم هستند. در محیط کشت سلول ESCs، 1000 U/ml فاکتور بازدارندهي لوکمیایی - - LIF اضافه شد. LIF با فعال کردن مسیر STATE3 نقش اساسی در خودنوزایی ESCs ایفا میکند.تزریق به بلاستوسیست: سلولها یک روز قبل از انتقال به حفرهي بلاستوسیست، روي لایهاي از سلولهاي MEF پاساژ داده شدند. در روز انتقال سلولها تریپسینه شده بعد از جدا شدن کلونها تریپسین با محیط کشت سلول خنثی شد کلونهاي ES با پیپتاژ به حالت منفرد در آمدند. سوسپانسیون سلولی به یک پلیت جدید منتقل شد 20 دقیقه انکوبه شد تا سلولهاي MEF ته نشین شده به پلیت چسپیدند.
مایع رویی که بیشتر حاوي سلولهاي بنیادي جنینی بود در1000 دوردر دقیقه به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ شد. پلیت در محیط M2 رسوسپانس شدند. بخشی از سلولها به همراه چند بلاستوسیست به پلیت تزریق منتقل شدند. توسط بازوي تزریقکنندهي میکرومنیپولیتور 16-8 سلول ES حاوي آلل ناقص ژن ADAM27 کشیده میشد. یک بلاستوسیست توسط بازوي نگهدارندهي میکرومنیپولیتور برداشته میشد. با استفاده از دو بازوي تزریقکننده و نگهدارنده ICM بلاستوسیست در موقعیت ساعت 12 یا 6 میگرفت. توسط بازوي تزریق کننده Zona Pellucida و لایهي سلولهاي تروفواکتودرم پاره شده و سلولها داخل حفرهي بلاستوسیست خالی میشدند. بعد از تزریق، سلولها 3-2 ساعت در انکوباتور میگرفتند. بلاستوسیستهایی که میتوانستند خود را بازیابی کنند به رحم موشهاي ماده ي Foster منتقل میشدند.
