بخشی از مقاله
چکیده
کالوسهاي جنین زا با استفاده از ریز نمونه هاي جنین بذر،اپی کوتیل، هیپوکوتیل و کوتیلدون ارقام بومی بکرایی، سیاورزر،دارابی و نارنگی بمی تولیدشدند. حدود 2 هفته پس از کشت ریز نمونه ها روي محیطهاي پایه MT - موراشی و توکر، - 1969 با سطوح مختلف ساکارز و هورمونها، کالوسها شروع به رشد کردند و طی دوره هاي 4 هفته اي در محیط تازه بدون هورمون واکشت شدند. تمایز جنین هاي سوماتیکی از کالوسهاي مختلف پس از گذشت حدود 60 روز از کشت اولیه آغاز شد. جنینها در آغاز به شکل نقاطی برجسته و زرد رنگ در کالوس ظاهر شده و به تدریج رنگ آنها به سبز روشن تغییر یافت.
قطر جنینهاي رشد یافته، بین 0/8 تا 2/3 میلیمتر متغیر بود. این جنین ها جدا شده و جهت تولید گیاهچه به محیطهایی با غلظتهاي مختلف هورمونهاي جیبرلیک اسید - - GA3 یا-1نفتالین استیک اسید - - NAA منتقل شدند. بیشترین درصد جنین زایی سوماتیکی از کالوسهاي ریزنمونه هاي جنین درمحیط حاوي 2,4-D 1/8 mgL-1 و BA 1mgL-1 و50 grL-1 ساکارزتحت شرایط تاریکی حاصل شد. جنین هاي حاصله بیشترین میزان رشد و تبدیل به گیاهچه کامل را در محیط هاي بدون هورمون یا با غلظت NAA 0/5 mgL-1 نشان دادند . جنین ها در این محیط ها همزمان تولید ریشه و ساقه کرده و تبدیل به گیاهچه کامل شدند.
کلمات کلیدي: کالوسهاي جنین زا ،جنین زایی سوماتیکی، سیاورز.
مقدمه :
ارقام بومی مرکبات ایران با وجود دارا بودن خصوصیات منحصر به فرد تا کنون کمتر مورد مطالعه قرار گرفته اند. این خصوصیات شامل تنوع زیاد در عطر و طعم، صفات کیفی مطلوب و سازگاري با آب و هوا و پاتوژنها می باشد. امروزه روشهاي این ویترو جهت تکثیر و تولید نهال، اصلاح ژنتیکی و تولید ارقام جدید و نیز دستکاري ژنتیکی و انتقال ژن کاربرد گسترده اي یافته اند . جنین زایی سوماتیکی یکی از پرکاربردترین تکنیکها است که در تکثیر کلونی ارقام و تولید پایه هاي عاري از بیماري ، باززایی سریعترگیاه پس از فرآیند انتقال ژن ، تولید گیاهان کامل در روش ادغام پروتوپلاست استفاده می شود. تابه حال تحقیقات فراوانی روي ارقام و گونه هاي مختلف مرکبات به منظور بهینه سازي تولید جنین هاي سوماتیکی صورت گرفته است. این تحقیقات بیانگر تفاوت فاحش در قابلیت جنین زایی سوماتیکی بین ارقام و ژنوتیپهاي مرکبات میباشند - . - 2
اولین بار ماهشواري و رانگاسوامی - - 1958 تولید جنین سوماتیکی را از بافت خورش بذر گزارش کردند - . - 8میترا و چادرودي - 1972 - همبستگی مستقیمی را بین خصوصیت چند جنینی و قابلیت تولید جنین هاي سوماتیکی گزارش کردند - . - 9 طی سالها گزارشهاي متعددي از تولید جنین سوماتیکی از بافت هاي مختلف : تخمکهاي لقاح نیافته - بوتن و همکاران، - - 1 - 1974 ،پروتوپلاست - کونیتاکی و همکاران ، - - 6 - 1991، وزیکولهاي آبدار میوه - نیتو و ایوامازا ، - - 12 - 1990 ، قطعات اپی کوتیل ، هیپوکوتیل و ریشه - گیل و همکاران ، - - 3 - 1995 و پروتوپلاست - نیدز، - - 11 - 2006 ارائه شده است . در این تحقیق تولید جنین هاي سوماتیکی از ریزنمونه هاي مختلف چهار رقم بومی مرکبات شامل بکرایی، سیاورز، دارابی و نارنگی بمی بررسی شد .
مواد و روشها:
ریزنمونه هاي مختلف شامل جنین هاي بذري و قطعات اپیکوتیل، هیپوکوتیل و کوتیلدون ازگیاهچه هاي این ویترو چهار رقم بومی شامل بکرایی، سیاورز، دارابی و نارنگی بمی، با الکل % 70 به مدت 30 ثانیه و محلول کلرین %1 و Tween20 % 0/1 به مدت 12 دقیقه ضدعفونی شدند.این نمونه ها در محیطهاي مختلف شامل محیط پایه MT - موراشیگ و توکر، - 10 - - 1969 همراه با دو سطح ساکارز - 30grL-1و - 50 وسطوح مختلف هورمونهاي 2و-4دي کلروفنوکسی استیک اسید - 2,4-0 - D - ، 0/2، 0/5، 1، 1/5 و - mgL-1 2 و-6بنزیل آدنین 0 - - BA - ، 0/5،1و mgL-11/5 - کشت شده و درشرایط مختلف تاریکی و یا نور - 16 ساعت روشنایی در روز - نگهداري شدند. پس ازآزمایشات اولیه، براي تعیین دقیق تر محیط اپتیمم، 4 غلظت 1/4 - ، 1/6 ، 1/8 و2,4-D - mgL-12 همراه با
BA 1mgL-1 مورد آزمون قرار گرفتند.
کالوسهاي تولید شده هر4 هفته در محیط جدید MT با 50grL-1 ساکارز و عصاره مالت - - 500 mgL-1 بدون هورمون واکشت شدند. جنین هاي سوماتیکی پس از تمایزجهت تولید گیاهچه به محیطهايMT با غلظتهاي مختلف هورمونهاي جیبرلیک اسید - - GA3 یا-1نفتالین استیک اسید - 0 - - NAA ،0/5 و - mgL-1 1 منتقل شدند. این تحقیق با 5 تکرار از هر رقم - سه پتري شامل 4 نوع ریزنمونه - انجام شد. تجزیه هاي آماري توسط نرم افزار آماري MSTATC انجام شد.
نتایج و بحث:
کالوسها سه هفته بعد از کشت ریزنمونه ها شروع به رشد کرده و اولین جنین هاي سوماتیکی با گذشت حدود60 روز شروع به تمایز کردند. استفاده از50 grL-1 ساکارز نسبت به 30grL-1، بطور متوسط موجب افزایش %66 در میزان جنین هاي حاصله شد. بیشترین درصد جنین زایی سوماتیکی ازکالوسهاي ریزنمونه هاي جنین بذري درمحیط حاوي2,4-D 1/8 mgL-1 وBA 1 mgL-1 وgrL-1 50 ساکارز تحت شرایط تاریکی مشاهده شد - %28 کالوسها - . جنینها در آغاز به شکل نقاطی برجسته درکالوس با رنگ زرد روشن مشاهده شدند - شکل1الف - و به تدریج رنگ آنها به سبز روشن تغییر یافت - شکل1 ب - . لینگ و ایوازاما - 1997 - در محیطهاي حاوي ساکارز جنین زایی مشاهده نکردند و تنها با استفاده از 50grL-1 لاکتوز جنین زایی مشاهده شد - . - 7
درتمام ارقام حداکثر جنین زایی در کالوسهاي جنینی %52 - کل جنین هاي سوماتیکی - مشاهده شد، در حالیکه ازکالوسهاي هیپوکوتیل جنین سوماتیکی تولید نشد. سونگ و دنگ - - 2006نیز با مطالعه روي نوعی پوملو چینی، حداکثر جنین زایی را از ریزنمونه جنین بذر گزارش کردند - . - 13 ارقام دارابی، سیاورز، بکرایی و نارنگی بمی به ترتیب بیشترین جنین سوماتیکی را تولید کردند - به ترتیب 39 ، 31 ،21 و9 % - .این نتیجه مؤید گزارشات هو و همکاران - - 1999 است که جنین زایی از نارنگی ها را مشکل توصیف کرده بودند - . - 4 کاول و سینگ 2005 - - نیز قابلیت جنین زایی سوماتیکی درگروههاي لیمو و پرتقال بیش ازگروه نارنگی گزارش کرده بودند - . - 5
تنها %23 جنینها پس از انتقال به محیطهاي تولید گیاهچه، تمایز یافته - شکل - 2و توانستند گیاه کامل ایجاد کنند که بیشترین گیاهچه ها در محیطهاي بدون هورمون یا با غلظت NAA 0/5 mgL-1 تولید شدند - . - %83 غلظت NAA 1 mgL-1 و کلیه غلظتهاي GA3 روي تمایز جنینها اثر منفی داشتند. لینگ و ایوازاما - 1997 - بیشترین گیاهان را از جنین هاي سوماتیکی در محیط با NAA 0/02 mgL-1 بدست آوردند.این نتایج با مشاهدات نیدز - - 2006 که جنینهاي سوماتیکی را در محیط باGA3 0/5 mgL-1 باززایی کرد، مغایرت دارد - . - 11 در این پژوهش قابلیت جنینهاي بذري به عنوان بهترین ریزنمونه جهت تولید جنین هاي سوماتیکی اثبات شد و روشی براي تولید جنینهاي سوماتیکی از ارقام بومی بکرایی، سیاورز، دارابی و نارنگی بمی معرفی شد
