بخشی از مقاله
چکیده:
جمینیویروسها از مهمترین ویروسهای بیماریزای گیاهی میباشند که پس از ویروسهای با ژنوم آر ان ا مثبت بیشترین تعداد ویروسهای گیاهی را شامل میشوند. در این تحقیق کاربرد مواد رادیو اکتیو در ردیابی دقیق و همچنین تعیین فرم تکثری ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند ارزیابی شده است.
تلقیح همسانه عفونت زای ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند در گیاهان توتون - 1LFRWLDQD DPLDQDEHQWK - سبب بروز علایم کوتولگی شدید و پیچیدگی برگ به طرف بالا در %90 گیاهان تلقیح شد. هیبریداسیون دی ان ا با کمک مواد رادیواکتیو بیانگر وجود فرمهای تکثیری این ویروس در گیاهان آلوده بود.
مقایسه نتایج بلات نقطه ای و واکنش زنجیرهای پلیمراز نشان داد که استفاده از هیبریداسیون دی ان ا در ردیابی ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند دقیق تر از روش واکنش زنجیرهای پلیمراز میباشد. . بنابراین هیبریداسیون دی ان ا روشی مطمئن و مناسب در تعیین فرمهای تکثیری و ردیابی ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندر قند و سایر دی ان ا ویروسهای گیاهی می باشد.
مقدمه
ویروسهای گیاهی مجموعهای از یک یا چند مولکول اسید نوکلئیک - دی ان ا یا ار ان ا - میباشند که معمولا داخل یک پوشش حفاظتی پروتئینی قرار گرفته اند. ویروسها تنها درون سلولهای میزبان مناسب قادر به تکثیر میباشند و همانندسازی آنها کاملا وابسته به سیستم ساخت پروتئین میزبان میباشد. ویروسهای گیاهی پیکرههای میلهای، چند وجهی و یا رشتهای دارند .از نظر ژنومی، اکثر ویروسهای گیاهی دارای ژنوم از نوع آر ان ای و تعداد قابل توجهی از ویروسهای مهم دارای ژنوم از نوع دی ان ای میباشند
خانواده جمینیویروسها شامل گروه بزرگی از ویروسهای گیاهی است که دارای ژنوم دی ان ا تک رشتهای، حلقوی یک یا دوبخشی با پیکرههای ایزومتریک - Isometric particles - دوقلو به ابعاد 18 تا 30 نانومتر میباشند. اندازه ژنوم دی ان ای این ویروسها دو و نیم تا سه کیلو دالتون میباشد. ویروسهای با ژنوم دو بخشی دارای دو قطعه با نام DNA-A و DNA-B میباشند که در روی هرکدام از قطعات یک سری از ژنها موجود میباشند. ژنهای مسئول در همانندسازی، تنظیم بیان ژن و کپسیده کردن در روی قطعه A و ژنهای مسئول در حرکات ویروسی و ژنهای تعیین کننده دامنه میزبانی و نوع علایم در روی قطعه B قرار دارند
جمینیویروسها دامنه وسیعی از گیاهان را آلوده میکنند و خسارت اقتصادی بالایی در محصولات مهم از قبیل گوجهفرنگی، لوبیا، کدو، چغندرقند، توتون و ذرت ایجاد میکنند. میزان خسارت این ویروسها بسته به تعداد گیاهان آلوده و سن گیاهان در موقع آلودگی بین 20 تا 100 میباشد
گیاهان آلوده به جمینیویروسها اغلب نشانههای پیسک مشخص تا نوعی موزائیک زرد را از خود نشان میدهند و برگ-هایشان ممکن است پیچیده و یا بد شکل گردد. وقتی گیاهان جوان آلوده به ویروس شوند بوتهها کوتوله شده و کپهای می-مانند. آلودگی گیاهان مسنتر منتج به کاهش رشد شاخ و برگ جدید و کاهش تشکیل میوه میشود
همانندسازی جمینیویروسها توسط مکانیسم دایره غلتان - Rolling Circle Replication - شبیه باکتریوفاژهایی مثل
M13 و پلاسمیدها می باشد. همانندسازی در هسته سلولهای آلوده گیاهی رخ میدهد. ابتدا دی ان ا تک رشتهای حلقوی به دی ان دو رشتهای حد واسط یا فرم تکثیری تبدیل میشود و سپس مکانیسم دایره غلتان شروع میشود که در آن رشتهی دی ان ا در یک سایت مشخصی واقع در مبداء همانندسازی توسط پروتئین تکثیری - Replication-associated protein - شکاف داده میشود تا همانندسازی شروع شود
شکل 0 - 1مکانیسم دایره غلتان و همانند سازی جمینیویروسها
درگیاهان آلوده به جمینیویروسها علاوه بر دی ان ا ژنومی انواع مختلفی دی ان ا کوچکتراز ژنوم نیزحضوردارند که برخی از ژنوم ویروس مشتق شده ویا دارای توالیهای متفاوت از ژنوم ویروس هستند. بیشتر این مولکولها برای همانند سازی، پروتئین پوششی وحرکت درگیاه به ویروس اصلی وابسته هستند. دی ان ا های ناقص، دی ان اهای ناقص مداخله گر و دی ان ا ستلایتها از این گروه مولکولها می باشند .این مولکولهای کوچک دی ان ا بر میزان و شدت بیماری ویروسی تاثیر گذارند.
شناسایی فرمهای تکثیری جمینیویروسها و همچنین مولکولهای کوچک دی ان ا مرتبط با آنها در مطالعه تکثیر این
ویروسها و همچنین بهرهگیری از این مولکولها در بیوتکنولوژی اهمیت دارد. از روشهای دقیق و حساس در مطالعه فرم-های تکثیری جمینیویروسها و ردیابی مولکولهای کوچک دی ان ا مرتبط، استفاده از روش ساترن بلات یا دات بلات می- باشد. در این تحقیق با کمک کاوشگرهای نشان دار شده با مواد رادیواکتیو - 32P - فرمهای تکثیری و همچنین میزان آلودگی گیاه توتون - Nicotiana benthamina - به ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند بررسی میگردد.
مواد و روشها
تلقیح گیاهان با همسانه عفونت زای ویروس
در این تحقیق از همسانه عفونتزای ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند - Beet curly top Iran virus - استفاده شد. همسانه عفونتزای ویروس که حاوی قطعه دی ان ا معادل یک و چهار دهم برابر ژنوم ویروس میباشد - ٍ , Eini et al - unpublished در یک حامل دوتایی وارد گردید.
سپس این همسانه به سلولهای باکتری Agrobacterium tumefacience سویه GV3101 با روش شوک دمایی منتقل شد. پس از گزینش سلولهای باکتری با کمک آنتی بیوتیک کانامایسین 50 - میکروگرم در میلی لیتر - ؛ گیاهان توتون با روش اگرواینوکولیشن - Kheyr-Pour et al., 1991 - با باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب میباشد مایع زنی شدند. علایم بیماری 14 تا 28 روز بعد از آلودگی بررسی و از گیاهان دارای علایم پیچیدگی برگ و کوتولگی نمونه برگی جمع آوری گردید.
استخراج دی ان ا ژنومی از برگ گیاه
برای استخراج دی ان ا ژنومی از نمونه های گیاهی از روش روحی بخش و همکاران - 2008 - با اندکی تغییرات استفاده شد.
ابتدا مقدار 100 میلیگرم از بافت برگ تازه یا فریز شده در هاون چینی استریل با کمک ازت مایع پودر گردید. سپس به میزان یک میلیلیتر از بافر 100 - Gem-CTAB میلی مولار تریس-کلریدریک اسید ، 10 میلی مولار EDTA و - C -TAB %2 که قبلا گرم شده 65 - درجه سانتیگراد - به تیوب حاوی پودر گیاهی اضافه گردید. و پس از مخلوط کردن به مدت یک ساعت در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده شد. حدود 0/8 حجم تیوب به آن کلروفرم: ایزوآمیل الکل - 1:24 - اضافه و به مدت 10 دقیقه به آرامی مخلوط شد. پس از سانتریفوژ نمونه ها به فاز رویی ایزوپروپانول سرد اضافه و رسوب دی ان ا تهیه شده با اتانول 80 درصد شستشو و پس از خشک شدن در 30 میکرولیتر آب مقطر استریل حل شدند.
