بخشی از مقاله
چکیده
ناقل طبیعی ویروس زردي نکروتیک رگبرگ چغندرقند عامل بیماري ریزومانیا شبه قارچ Polymyxa betae می باشد. این پارازیت اجباري خاکزي، ویروس هاي دیگري را در چغندرقند منتقل می کند. مقاومت ارقام مقاوم به ویروس و ناقل پایدارتر می باشند. شناسایی منابع جدید مقاومت بر علیه ناقل بیماري، نیاز به شناسایی دقیق، سریع و کمی P. betae دارد. در این بررسی پس از کاشت رقم حساس رجینا در مخلوطی با حجم مساوي خاك آلوده به ریزومانیا و کمپوست در شرایط گلخانه پس از 5 هفته، شناسایی ناقل با سه روش میکروسکوپی، سرولوژیکی و مولکولی صورت گرفت.
اسپورهاي استراحتی پس از رنگ آمیزي ریشه ها با محلول اسید فوشین- لاکتوفنل مشاهده شد. سیستم الایزاي کمی پس از تولید آنتی سرم اختصاصی پاتوژن در برابر پروتئین نوترکیب گلوتاتیون--s ترانسفراز با رقت هاي مختلف جهت تشخیص سریع و آسان ناقل در ریشه هاي آلوده بهینه سازي شد. با تکثیر همزمان منطقه اختصاصی rDNA ناقل و منطقه اختصاصی دیگري از ژنوم ناقل، گونه P. betae تایید شد. اندازه باندهاي تکثیري به ترتیب 500 bp و 170 bp بود. به این ترتیب می توان با سنجش دقیق و کمی P. betae در شناسایی ژرم پلاسم مقاوم چغندرقند نسبت به ناقل، پیش آگاهی بیماري ریزومانیا و شناسایی دیگر میزبان هاي آن بهره برد.
1 مقدمه
شبه قارچ P. betae یک پارازیت پلاسمودیوفوریدي اجباري خاکزي، و تنها ناقل طبیعی بسیاري از بیماریهاي ویروسی چغندرقند از جمله Beet Necrotic Yellow Vein Virus - BNYVV - ، Beet Soil- Born Virus - BSBV - ، Beet Soil- Born Mosaic Virus - BSBMV - ، Beet Virus Q - BVQ - ، Beet Oak Leaf Virus - BOLV - ، Beet Distortion Mosaic Virus - BDMV - شناخته شده است. ویروس زردي نکروتیک رگبرگ چغندرقندBNYVV عامل ایجاد بیماري ریزومانیا است که در حال حاضر از تمامی بیماري هاي چغندرقند مخرب تر بوده و از نظر اقتصادي مهمترین بیماري چغندرقند می باشد.خسارت آن معمولاً بیش از50 درصد و در بعضی موارد تا صددرصد برآورد گردیده است.
با توجه به ماهیت بیماري کاربرد روش هاي زراعی - از جمله تاریخ کاشت، آبیاري و تناوب زراعی - ، همچنین روش هاي شیمیایی و بیولوژیکی در مبارزه با آن چندان موفقیت آمیز نبوده است و لذا استفاده از ارقام زراعی متحمل / مقاوم بهترین و تنها راه مبارزه با این بیماري محسوب می شود. با توجه به تک ژنی بودن مقاومت به ویروس و خطر شکسته شدن مقاومت به دلیل ظهور تیپ هاي مهاجم تر ویروس، شناسایی منابع جدید مقاومت بر علیه ناقل بیماري از جمله راه کارهاي جایگزین می باشد.
ارزیابی مقاومت ژرم پلاسم چغندرقند به P. betae منوط به یک سیستم تشخیصی و سنجشی دقیق میباشد تا بتواند لاین هاي مقاوم به ناقل را شناسایی نماید. در این تحقیق P. betae در ریشه چغندرقند به سه روش میکروسکوپی، سرولوژیکی و مولکولی ردیابی شد و آزمون الایزا با استفاده از آنتی بادي اختصاصی پروتئین GST ناقل جهت ردیابی سریع و کمی ناقل در ریشه هاي گیاهان آلوده به P. betae جهت مطالعات تکمیلی و کاربردي بهینه سازي شد. همچنین آلودگی ریشه ها به ناقل با آغازگر اختصاصی منطقه rDNA پلاسمودیوفورومیست ها وآغازگر اختصاصی P. betae مورد بررسی قرار گرفت.
-2 مواد و روش ها
2-1 آزمایش هاي گلخانه اي گیاهچه هاي رقم حساس رجینا به مخلوطی از خاك آلوده به ریزومانیا - خاك آلوده از مزارع استان فارس تهیه شد - و کمپوست انتقال داده شدند پس از حدود 5 هفته ریشه چه گیاهان جهت ردیابی ناقل جداسازي و در دماي -20 درجه سانتیگراد نگهداري شد.
2-2 ردیابی میکروسکوپی ابتدا ریشه ها در محلول اسید فوشین- لاکتوفنل %5 به مدت یک دقیقه جوشانده و سپس با استفاده از اسکالپل از هر نمونه ریشه 10 قطعه 0/5 سانتی جدا و روي لام میکروسکوپ قرار گرفت و توسط میکروسکوپ نوري با بزرگنمایی 400 مشاهده و از نظر آلودگی به اسپورهاي مقاوم ناقل بررسی شد.
2-3 آزمون الایزا جهت ردیابی و برآورد غلظت P. betae پس از تهیه آنتی سرم پلی کلونال P. betae جدایه زرقان - استان فارس - ، ردیابی و اندازه گیري غلظت P. betae در ریشه چه گیاهان با استفاده از آزمون الایزا به روش ساندویچ دو طرفه آنتی بادي - - DAS- ELISA مطابق روش معمول Clark و Adams بهینه سازي شد.
3-3 مطالعات مولکولی
استخراج DNA از ریشه هاي خشک آلوده و سالم - شاهد - با استفاده از روش موتاسا و همکاران با تغییرات صورت گرفت - . - 3 جهت تکثیر اختصاصی منطقه rDNA در Polymyxa از جفت آغازگر [Psp1 - 5'- TAGACGCAGGTCATCAACCT-3' - Psp2rev - 5'- AGGGCTCTCGAAAGCGCAA-3' - ] استفاده شد - . - 1 پس از بهینه سازي اجزاي واکنش، نمونه ها در دستگاه ترموسایکلر تکثیر شدند و محصولات آن روي ژل آگارز 1 درصد بررسی شد. براي تایید گونه P. betae از واکنش زنجیره اي پلی مراز اختصاصی ژنوم آن توسط جفت آغازگرهاي PB4for و PB4rev استفاده شد - . - 3 جهت تکثیر همزمان منطقهrDNA مربوط به پلاسمودیوفورومیست ها و منطقه اختصاصیP. betae و همچنین اطمینان بیشتر در تشخیص ریشه هاي آلوده به آن از واکنش Duplex PCR آغازگرهاي Psp1 ، Psp2rev و PB4for ، PB4rev استفاده شد.
-3 نتایج
3-1 مشاهدات میکروسکوپی آلودگی ریشه هاي فرعی بوته هاي چغندرقند بعد از 5 هفته با مشاهده اسپورهاي مقاوم ناقل که به صورت 8 ضلعی و ردیف هاي 2 تا 5تایی با فراوانی زیاد از 5 تا 200 عدد در سلول هاي بافت اپیدرم مشاهده گردید - شکل. - 1 همچنین لوله هاي خروج - Exit-tubes - زیادي از سطح ریشه هاي فرعی بیرون آمد - شکل. - 2 در نمونه هاي سالم اسپور مقاوم مشاهده نشد.
3-2 ردیابی سرولوژیکی
آنتی سرم تولید شده بر علیه جدایه ایرانی P. betae توانست در رقت هاي 1/500، 1/1000 و 1/2000 بوته هاي چغندرقند آلوده به ناقل را از بوته هاي سالم تشخیص دهد. میزان OD همه نمونه هاي آلوده بالاتر از نمونه هاي سالم بود - جدول. - 1
