بخشی از مقاله
چکیده
تنوع ژنتیکی نیاز اصلی اصلاح نباتات است و جهشها این تنوع را افزایش میدهند. موتاسیون القایی، تکنیک امیدبخشی جهت اصلاح مؤثر گیاهان میباشد و پتانسیل بالایی در ایجاد تنوع ژنتیکی دارد. این پروژه به منظور بررسی میزان حساسیت کالوس سه رقم برنج ایرانی - فجر، نعمت و شفق - به پرتو گاما حاصل از کبالت 60 با دزهاي مختلف 0، 20، 40، 60، 80 و 100 گري و تعیین دز مناسب پرتو به منظور القاي تنوع ژنتیکی صورت گرفت. نتایج نشان داد که میزان رشد و باززایی کالوسهاي پرتو دیده هر سه رقم برنج با افزایش میزان دز پرتو روند کاهشی معنیداري نسبت به شاهد داشتند.
کاهش شدید میزان رشد و باززایی کالوس در دزهاي بالاي 40 گري مشاهده گردید به طوري که در دز 100 گري باززایی شاخساره در کالوس ارقام نعمت و شفق صورت نگرفت. کالوسهاي رقم فجر بر اساس صفات اندازهگیري شده حساسیت کمتري به پرتو گاما نسبت به دو رقم نعمت و شفق نشان دادند. با توجه به نتایج بررسی حاضر، دزهاي مناسب پرتو تابی براي هر سه رقم مورد بررسی در محدوده دزهاي 15 تا 27 گري پرتو گاما پیشنهاد میگردد.
مقدمه
افزایش روز افزون جمعیت جهان و محدودیت امکان گسترش اراضی زراعی و همچنین عوامل محدود کننده نظیر تنشهاي محیطی، نیاز به اصلاح و بهبود محصولات براي افزایش عملکرد در واحد سطح و بهبود کیفیت را ایجاب میکند. در راستاي حفظ و افزایش تولیدات کشاورزي، میزان و سطح تنوع ژنتیکی اهمیت بسیار زیادي دارد. از این رو براي موفقیت در یک برنامه اصلاحی، ایجاد تنوع ژنتیکی کافی مورد نیاز است.
در گیاه برنج، به خاطر ماهیت خودگشن بودن، نوترکیبی ژنها و تنوع در جمعیتهاي گیاهی کم میباشد، بنابراین براي به نژادي و دستیابی به ژنوتیپهاي برتر، به کارگیري روشهاي ایجاد تنوع در این گیاه ضروري به نظر میرسد. استفاده از تکنیک موتاسیون القایی به همراه تکنیکهاي کشت درون شیشهاي جهت ایجاد موتاسیون سوماتیکی نقش به سزایی در اصلاح محصولات زراعی ایفا میکند
تلفیق موتاسیون القایی و کشت درون شیشهاي به خاطر مزیتهاي زیادي از جمله موتاسیونزایی در قسمتهاي مختلف گیاه، یکنواختی تیمار موتاژن، به کارگیري تعداد زیادي نمونه در زمان کوتاه، تولید سریع جمعیت زیاد و راحتی انتخاب حائز اهمیت میباشد. در گیاه برنج ایجاد بافت کالوس از جنین بالغ در شرایط درون شیشهاي و القاي موتاسیون در بافت کالوس با موتاژنها به ویژه موتاژنهاي فیزیکی جهت ایجاد تنوع سوماتیکی در مطالعات زیادي مورد بررسی قرار گرفته است
فاکتورهایی مثل میزان دز پرتو و نوع رقم برنج موفقیت در این روش را به شدت تحت تأثیر قرار میدهد. جهت افزایش محتوي آمینواسید تریپتوفان در کولتیوار برنج Donganbyeo، کالوسهاي حاصل از کشت جنین تحت تأثیر دز 50 گري پرتو گاما قرار گرفتند
مطالعه حاضر به منظور بررسی میزان رشد و حساسیت کالوسهاي ارقام برنج ایرانی به پرتو گاما و تعیین دز مناسب جهت ایجاد تنوع ژنتیکی در ژنوم برنج میباشد که امید است در پروژههاي اصلاحی این گیاه از طریق القاء موتاسیون مفید واقع گردد.
مواد و روشها
در این تحقیق از بذور الیت سه رقم بومی فجر، نعمت و شفق استفاده گردید. جهت ضد عفونی سطحی مواد گیاهی، شلتوكهاي هر سه رقم به مدت دو دقیقه در الکل 70 درصد غوطهور شدند سپس در محلول هیپوکلریت سدیم - وایتکس - 15 درصد - حجم/حجم - حاوي دو قطره توئین 20 به مدت 15 دقیقه قرار گرفتند و در نهایت دو بار با آب مقطر دو بار استریل آبشویی شدند.
بعد از پوستکنی شلتوكها، مراحل استریل بذور با ترکیبات ضدعفونی کننده قبل به مدت 25 دقیقه و بر روي بذور سفید ادامه یافت و سپس بذور با آب مقطر دو بار استریل در محفظه هود لامینار آبشویی شدند. بذور استریل شده بر روي محیط کشت کالوسزایی 1MS، حاوي 2 میلیگرم در لیتر 2-4-D، 0/1 گرم در لیتر مایواینوزیتول، 3 درصد ساکارز و 7 گرم در لیتر آگار کشت شدند. سپس در داخل انکوباتور و با شرایط تاریکی و دماي 27±1 درجه سانتیگراد به مدت چهار هفته نگهداري شدند.
کالوسهاي بدست آمده، با شش دز مختلف پرتو گاما - دزهاي 0، 20، 40، 60، 80 و 100 گري - حاصل از کبالت 60 پرتودهی شدند بطوریکه تعداد30 تا40 کالوس براي هر سطح پرتو در نظر گرفته شد. سه هفته بعد از پرتوتابی، درصد زندهمانی کالوسهاي پرتو دیده و شاهد محاسبه گردیدند. کالوسهاي زنده مانده جهت باززایی روي محیط کشتLS2 حاوي تنظیم کنندههاي رشد نفتالین اسیداستیک 0/5 - میلیگرم در لیتر - و بنزیل آمینوپورین - 1 میلیگرم در لیتر - کشت گردیدند و در شرایط فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی در دماي 26 درجه سانتیگراد نگهداري شدند.
بعد از گذشت سه هفته، آمار برداري از کالوسهاي باززا شده انجام گرفت. زمانیکه شاخساره ها حدوداً سه تا چهار سانتیمتر رشد نمودند، تعداد شاخساره باززایی شده در کالوس براي تیمارهاي مختلف شمارش گردید. شاخسارههایی با طول 3 تا 4 سانتی متر بر روي محیط کشت ریشهزایی LS فاقد تنظیم کننده رشد کشت شدند و به مدت دو هفته در اتاقک رشد و دمايº26 c نگهداري شدند.
پس از ریشه دار شدن شاخسارهها، گیاهچههاي حاصله به شرایط هیدروپونیک حاوي محلول غذایی یوشیدا منتقل شدند. گیاهچههاي استقرار یافته به گلخانه منتقل و در گلدانهاي پلاستیکی حاوي خاك رس منتقل شدند. آزمایش به صورت فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی شامل شش سطح پرتو گاما و سه رقم برنج ایرانی در ده تکرار اجرا گردید.
تجزیه واریانس دادهها با استفاده از نرم افزار سیستم پردازش آماري SAS - نسخه - 9,1 صورت گرفت و مقایسه میانگینها با استفاده از آزمون حداقل تفاوت معنی دار - LSD - در سطح احتمال یک درصد انجام شد. جهت رسم نمودار و تعیین معادله خط رگرسیونی از نرم افزار Excel استفاده گردید. سپس با استفاده از تجزیه رگرسیونی و پروبیت دادهها، رابطه مناسب بین دز و صفت اندازهگیري شده برآزش گردید و بر اساس رابطه بدست آمده دز مناسب تعیین گردید.
نتایج و بحث
تجزیه واریانس دادهها نشان داد که دزهاي مختلف پرتو گاما تأثیر معنیداري بر زندهمانی و باززایی کالوس گیاه برنج در سطح احتمال یک درصد دارد و همچنین ژنوتیپها براي صفات درصد زندهمانی و باززایی با هم اختلاف معنیداري در سطح احتمال %1 نشان دادند. تأثیر پرتو گاما و نوع رقم بر نسبت تعداد شاخساره باززایی شده در کالوس در سطح احتمال یک درصد معنیدار بود. برهمکنش معنیداري بین ژنوتیپ با دز پرتو گاما بر میزان زندهمانی و باززایی کالوس مشاهده گردید
نتایج مقایسه میانگینها نشان داد که پرتو گاما اثرات مستقیمی بر روي میزان زندهمانی، باززایی و تعداد شاخساره باززایی شده در کالوس دارد. مشاهده شد که میزان زندهمانی با افزایش دز پرتو روند کاهشی نشان داد به طوري که در بالاترین سطح دز 100 - گري - کمترین میزان زندهمانی کالوس حاصل گردید. همچنین اثر کاهشی پرتو گاما در صفات میزان باززایی و تعداد شاخساره در کالوس مشاهده گردید. در هر سه رقم، رشد و میزان باززایی کالوسها در تیمار شاهد نسبت به کالوس هاي پرتو دیده بالاتر بود
با این حال، رقم فجر حساسیت کمتري نسبت به دو رقم شفق و نعمت نشان داد. کالوسهاي پرتو دیده در رقم فجر در دز 20 گري میزان کاهش کمتر از 50 درصد زندهمانی نسبت به شاهد را نشان داد در حالی که دو رقم دیگر کاهش بیشتر از 50 درصدي زندهمانی کالوس را داشتند
بازدارندگی رشد در اثر پرتوتابی با دزهاي بالا به توقف در چرخه رشد در فاز G2 متافاز در طول تقسیم سوماتیکی سلول و یا خسارات متعدد در داخل ژنوم نسبت داده شد. آثار تخریبی پرتو بر روي سلولها و ایجاد جهشهاي نامطلوب و نیز اثرات مخرب ناشی از رادیکالهاي آزاد و دیگر مواد بازدارنده رشد سلولها در توده کالوس در اثر تیمار پرتو گاما را میتوان به عنوان علل کاهش رشد سلولهاي کالوس در نظر گرفت . - 4 - منفی بودن میزان همبستگی، نشان دهنده رابطه معکوس بین صفات و دز اشعه است و با افزایش شدت دز، میزان رشد و باززایی کالوس کاهش مییابد
اثر متقابل دز پرتو با ژنوتیپ در مورد میزان زندهمانی و باززایی شاخساره در سطح احتمال یک درصد تاثیر معنی داري نشان داد به عبارت دیگر در سطح ثابتی از تیمار پرتودهی، واکنش رشد و باززایی کالوس ارقام مختلف متفاوت بوده است. بنابراین نمیتوان یک دز LD50 را براي تمامی ارقام پیشنهاد کرد. بیشترین میزان زندمانی و باززایی کالوس در تیمار شاهد در رقم فجر مشاهده گردید در حالی که کمترین میزان زندمانی در رقم شفق در بالاترین سطح دز پرتو 100 - گري - مشاهده گردید
دزي که بتواند 50 درصد نمونهها را از بین ببرد - LD50 - ، به عنوان دز ایده آل شناخته شده و معمولاً 20 درصد این مقدار را به عنوان دز مناسب در پروژههاي اصلاحی بکار میبرند . - 5 - براي تعیین دزهاي LD50، از تجزیه پروبیت استفاده شد و معادلات خطی مربوط به صفت درصد مرگ و میر کالوس نسبت به شاهد براي هر یک از ارقام مورد بررسی، تعیین گردید
دز LD50 بدست آمده در هر رقم را به عنوان دز مناسب جهت القاء موتاسیون در کالوس پیشنهاد میگردد. از طریق تجزیه پروبیت براي تمام ارقام، دز LD50 برابر 20 گري بدست آمد. بر اساس نتایج حاصل از این آزمایش، در صورتی از دز 20 گري استفاده شود، در رقم نعمت %53 ، رقم فجر %42 و در رقم شفق %55 مرگ و میر کالوس اتفاق میافتد که به غیر از رقم فجر، بالاي %50 مرگ و میر کالوس در سایر ارقام حاصل میگردد.
جدول -1 تجزیه واریانس براي صفات درصد زندهمانی، باززایی گیاه و نسبت تعداد شاخساره باززایی شده
