بخشی از مقاله
چکیده
حوادث اخیر ناشی از آلودگی شیرخشک نوزاد، نشان داده استانداردها یا فاکتورهای قدیمی کنترل کیفیت شیر در تشخیص شیر تقلبی و دستکاری کیفی شده ناکافی می باشند. در این مطالعه، برای اولین بار تشریح شد که شیر گاو حاوی مقادیر زیادی از microRNAها - miRNAs - است و این که می توان پروفایل بیان یکسان از miRNA های مخصوص شیر به عنوان یک نشانگر جدید و احتمالا استاندارد جدیدی برای کنترل کیفیت شیر خام و سایر فرآورده های شیری تجاری نظیر شیرهای مایع و پودر شیر خشک به کار برود . در مرحله اول، با تعیین توالی Solexa، miRNAها غربال شده و نهایتا miRNA 245 در شیر خام تعیین هویت گردیدند.
برخلاف سایر نشانگرهای زیستی قدیمی که سطوح بیان آنها در دوره های مختلف شیردهی تقریبا یکسان است،miRNA های تکی در پروسه شیردهی می توانند تحت تاثیر عوامل مختلف، تغییر مشخصی کنند که دال بر این است که miRNAها ممکن است نشانگرهای دقیق تری برای بازتاب نمایش تقلب کیفی در شیر باشند. در دومین مرحله، با استفاده از Taq Man probe based miRNA quantitative RT-PCR، هفت miRNA که بیان نسبتا ثابتی در دوره شیردهی داشتند تعیین هویت شدند و بسیار مهمتر این که بیان این هفت miRNAهای مخصوص شیر می تواند به عنوان یک نشانگر زیستی ایده آل برای ایجاد تمایز و تشخیص کیفیت ضعیف یا شیر تقلبی و دستکاری شده از شیر خام خالص به کار گرفته شود. همین طور برای کنترل کیفیت فرآورده های شیری نظیر شیر مایع و پودر شیر خشک. یافته های موجود بنیانی را برای درک تنش فیزیولوژیکی miRNAهای شیر و استاندارد بالقوه جدید برای تعیین کیفیت شیر خام و محصولات شیری تجاری فراهم می آورد.
-1 مقدمه
تغذیه با شیر ضروری ترین فرآیند پی ریزی بنیان سلامت بشر بعد از تولد است. شیر و فرآورده های شیری دارای توازن خوبی از پروتئین، چربی و کربوهیدرات است و منبع مهمی از مواد مغذی ضروری شامل مواد معدنی، ویتامینها، ریبوفلاوین، پانتوتنیک اسید و غیره می باشد . با این حال، کمبود و فقدان نشانگرهای زیستی دقیق و کارآمد برای تشخیص محتویات شیرخام نمایانگر وظیفه ای سنگین و ترسناک برای کنترل کیفیت شیر است، اگرچه نشانگرها و مؤلفه های فعلی کنترل کیفیت شیر نظیر میزان پروتئین، چربی، قندها یا یونها در تشکیل و ایجاد استانداردها در بسیاری صنایع مفیدند اما این نشانگرهای منفرد به راحتی قابل دستکاری بوده و بنابراین برای پایش محتوی شیر چندان کارآمد نیستند .
برای مثال ملامین که برای افزایش سطح پروتئین به شیر اضافه شد. اگرچه با بازرسی های سختگیرانه می توان به طور مؤثری آلودگی با ملامین را کشف نمود اما سایر مواد سمی نیز ممکن است همزمان به شیر بی کیفیت اضافه شوند تا محصول نهایی به حد استاندارد برسد و پیامد آن می تواند خطر بزرگتری را برای سلامت انسان مطرح نماید. مشکل شیر دستکاری شده با کیفیت پایین را نمی توان حل کرد مگر با به کارگیری یک نشانگر زیستی نوین که نه تنها کیفیت شیر خام را بازتاب می کند بلکه با دستکاری شیر، تغییر کرده و مخفی کردن آن هم بسیار مشکل است.
اخیرا، کلاس جدیدی از ژنهای تنظیمی RNA تحت عنوان - miRNA - microRNA یافت شده اند که برگ جدیدی از تنظیم ژن در یوکاریوتها را معرفی می کنند. miRNAها، RNAهای درون زاد بدون رمزگذاری شامل 19 تا 24 نوکلئوتید - در طول - هستند. آنها نقش مهمی در تنظیم بیان ژن به وسیله جفت شدن با جایگاههای مکمل روی mRNAهای هدف از طریق بلوکه کردن ترجمه یا راه اندازی تجزیه آنها هدف بازی می کنند.
مطالعه های اخیر نشان داده که miRNAها در بسیاری از مایعات بدن به صورت ثابت حضور دارند نظیر سرم، پلاسما، بزاق، ادرار و مایعات فوقانی کشتهای سلول و این که الگوهای بیان یکسان miRNA در مایعات مختلف بدن ممکن است به عنوان نشانگرهای زیستی غیر تهاجمی یا کمتر تهاجمی برای بیماریهای متفاوت بکار گرفته شود . در این تحقیق، کار بر روی miRNAهای حلقوی گسترش یافت و یک نشانگر زیستی بر پایه miRNA ساخته و بنا نهاده شد . به طور مشخصی نشان داده شد که miRNAها در شیر خام بسیار زیاد بیان می شوند .
هفت miRNA وابسته به شیر، miR-26a، miR-26b، miR-200c، miR-21، miR-30d، miR-99a، miR-148a به عنوان نشانگرهای زیستی بالقوه برای کنترل کیفیت شیر خام و سایر محصولات شیری نظیر شیرهای مایع تجاری، پودر شیر خشک نوزاد و غیره شناسایی شدند.
-2 نتایج :
-1-2 بیان گسترده ژنومی miRNA در شیر گاو در مراحل مختلف شیردهی
برای آزمون وجود ثبات miRNA در شیر خام، ابتدا تکنیک تعیین توالی Solexa استفاده شد تا بانک اطلاعاتی همه RNAهای کوچک شیر خام طبیعی بنا شود. به عنوان یک تکنولوژی تعیین توالی با توان عملیاتی بالا که تولید نتایج و خروجی های بسیار دقیق، تجدیدپذیر و کمی از بیان RNAهای کوچک می نماید Solexa می تواند تمام مولکولهای RNA شامل miRNA با سطوح بیان ژن مختلف را تعیین و تعریف نماید و miRNAها را از سایر RNAهای کوچک به طور کاملا شفافی متمایز نماید که برای این کار به بانک اطلاعات RNAهای ثبت شده متفاوت رجوع می کند.
با استفاده از این روش حدودا مجموعه ای از 2487394 قرائت از شیر کامل و بالغ و 3398788 قرائت از آغوز تعیین و کشف شد. کلیه RNAهای تعیین توالی شده با Solexa به طول 18-30 نوکلئوتید هستند. متعاقبا، RNAهای کوچک در بخشهای مختلفی مطابق با خصوصیات زیستی و سایر ویژگیها طبقه بندی شدند. هم شیر کامل و هم آغوز حاوی RNAهای کوچک ناهمگنی شامل miRNAها، بخشهای تجزیه شده rRNAها و بخشهای mRNA هستند. در شیر، miRNAها بخش عمده گونه های RNA های کوچک هستند. بعد از طبقه بندی، مشخص شد مجموعه قرائتهای miRNAها در شیر کامل شبیه آغوز است. - 1418136 قرائت در شیر خام در مقابل 1594965 قرائت در آغوز - برای بررسی بیشتر بیان miRNAها در شیر خام، miRNAهای تعیین هویت شده در شیر با آنچه در آغوز تعیین هویت شده بود مقایسه شد.
با رجوع به miRBase13 0، تعیین توالی Solexa، حدود 213 و miRNA 230 شناخته شده را در شیر خام و کلستروم تعیین هویت نمود. چنانچه در شکل 1A نشان داده شده است، بیشتر miRNAها در شیر و آغوز تعیین هویت و کشف شدند در حالی که فقط تعداد کمی از miRNAها هم در شیر و هم در آغوز وجود داشتند. miRNAهای مخصوص آغوز شامل miR-18b، miR-19a، miR-140-5p، miR-219-5p و غیره هستند در حالی که miR-9 و miR-10b و بقیه به طور اختصاصی متعلق به شیر کامل هستند. متعاقبا، آنالیز بیشتری برای انتخاب گروهی از miRNAها که هنگام بیان بین شیر کامل و آغوز متفاوت و متمایز می شوند انجام گرفت.
آنالیزها نشان دهنده 116 miRNA در این گروه بود که در شیر کامل و آغوز به طور متمایز بیان می شوند که در آغوز - در مقایسه با شیر کامل - miRNA108 به صورت بالادستی و miRNA 8 به صورت پایین دستی تنظیم می شوند. به بیان دیگر، غلظت miRNA در شیر کامل در مقایسه با آنچه که در آغوز است کاهش یافته است. این نتایج نشان دهنده تغییر پویای ترکیب miRNA شیر در حین دوره شیردهی است. با این حال در مقابل کاهش قابل توجه در غلظت miRNA در شیر کامل نسبت به آغوز، سطوح پروتئین در آنها تقریبا ثابت بود.
مشاهده جالب توجه دیگر این بود که همه miRNAهای موجود در سیستم ایمنی و پاسخهای ایمنی نظیر miR-181a، miR-155 و miR-223 در شیر، بسیار فراوان و همچنین در آغوز نیز بیان می شوند - جدول . - 1 در مقابل miRNAهای تخصصی بافت نظیر miR-9/124a - مغز - ، miR-183/184 - اعضای حسی - ، miR-1/133 - ماهیچه - ، miR216/217 - پانکراس - ، miR-122 - کبد - ، miR-126 - قلبی عروقی - و miR-451 - سلول خونی - ، به میزان بسیار کم در شیر کامل و آغوز بیان شدند.
با این که پایه مولکولی مرتبط با این فرضیه برای نشان دادن باقی می ماند، فریبنده خواهد بود اگر فکر کنیم منبع چنین miRNA های مرتبط با سیستم ایمنی ممکن است نقش مهمی در تولید زیستی و ایجاد و توسعه سیستم ایمنی در نوزادان داشته باشند. در این رابطه، کاهش این miRNAها در شیر کامل در مقایسه با آغوز همسو و هماهنگ با نیاز به ایجاد و گسترش سیستم ایمنی نوزادان بود.
-2-2 شناساییmiRNAهای مخصوص شیر یا غنی شده در شیر
برای شناسایی miRNAهای مخصوص شیر یا غنی شده در شیر، پروفایل بیان miRNA موجود در نمونه های سرم گاوهای سالم ارزیابی و سپس با استراتژی یکسان پروفایل بیان miRNA سرم گاو و شیر همان گاوها بررسی و ارزیابی و مقایسه شد. در این مقایسه، سطوح میانگین بیان miRNAها در آغوز و شیر کامل برای نمایش سطوح عمومی miRNA در شیر خام بکار گرفته شد . اگر چه غلظت پروتئین در شیر حدود یک سوم کمتر از سرم بود serum=60-80g/litr - در برابر - milk=25-35g/litr، میزان کلی miRNAها در شیر دو برابر بیشتر بود. تعیین توالی Solexa و طبقه بندی RNA مشخص نمود که پروفایل بیان miRNAها در سرم و شیر کاملا با یکدیگر تفاوت دارد.
مطابق شکل 1B،miRNA47 در شیر خام وجود داشت که بیان شد اما در سرم از بین رفته بودند، در همین حال سرم حاوی miRNA162 جدید در مقایسه با شیر بود. همانگونه که در نمودار پراکندگی رابطه پیرسون نشان داده شده است، ضریب رابطه پیرسون - R - بین miRNAهای شیر و سرم بسیار کم بود. با استفاده از معیارهای یکسان انتخاب miRNA با بیان متفاوت شامل بیش از 20 بار کپی و تغییر مقدار بیش از 2 برابر ، 105 miRNA شناسایی شدند که صرفا مخصوص شیر در مقایسه با بیان miRNA در سرم بودند.
-3-2 هفت miRNA اختصاصی شیر به عنوان نشانگر کنترل کیفیت آن
برای بنیان گذاری یک نشانگر بر پایه miRNA برای مشخص کردن کیفیت شیر، هفت miRNA که بیان نسبتا بالا و ثابتی در شیر خام طی دوره های شیردهی مختلف داشتند - بیش از 3000 قرائت با روش Solexa، - <2 شیرخام/ آغوز - 0/5< به عنوان نشانگرهای بالقوه برای صحه گذاری بیشتر انتخاب شدند.
