بخشی از مقاله
چکیده
رتروترنسپوزون ها عناصر رایج در ژنوم گیاهان میباشند که فراوانی، توزیع وسیع، یکنواختی و قابلیت جابجایی آنها، استفاده از آنها را به عنوان نشانگرهاي مولکولی ایدهآل میسازد. به منظور تشخیص وقایع درج رتروترنسپوزونها در ژنوم یونجه و همچنین بررسی تنوع درون و بین جمعیتی 8 جمعیت 80 - ژنوتیپ - یونجه زراعی از آغازگرهاي منفرد و ترکیبات آغازگري مبتنی بر خانوادههاي رتروترنسپوزونی Tms1 Ret1 از Medicago Sativa، LORE1 و LORE2 از Lotus Japonicus و Tps12a و Tps19 از Pisum sativum استفاده شد. در کل با استفاده از 10 آغازگر IRAP، 66 مکان چند شکل در بین جمعیتهاي مورد مطالعه تولید شد. تجزیه کلاستر به روش UPGMA بر اساس ضرایب فاصله ژنتیکی نی جمعیتها را در 3 خوشه اصلی گروهبندي کرد.
فاصله ژنتیکی بین جمعیتها از 0/063 - قرهیونجه ملک کندي و ترکیه ساکوئل - تا 0/151 - ترکیه ساکوئل و آذربایجان اوردوبار - متغیر بود و میانگین آن 0/11 بود. میزان تنوع ژنتیکی درون جمعیتها - 90% - در مقایسه با بین جمعیتها - 10% - زیاد بود که بیانگر عدم تفاوت آشکار در بین جمعیتهاي مورد مطالعه است. میانگین هتروزیگوسیتی در جمعیتهاي مورد مطالعه از 0/208 - جمعیت همدانی - تا 0/261 - جمعیت قره یونجه ملک کندي - متغیر بود و میانگین آن برابر 0/238 بود. نتایج نشان داد که نشانگرهاي مبتنی بر خانوادههاي رتروترنسپوزونی از L. Japonicus و P. Sativum که از خویشاوندان نزدیک M. sativa هستند میتوانند به عنوان نشانگر مولکولی در یونجه مورد استفاده قرار گیرند.
واژههاي کلیدي: یونجه، رتروترنسپوزون Tms1Ret1، نشانگرهاي IRAP، تجزیه واریانس مولکولی
مقدمه
یونجه - Medicago sativa L. - یکی از مهمترین گیاهان علوفه اي براي تغذیه دام بوده که با وسعت کشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آن امروزه بسیار توسعه یافته است. اصلاح منابع ژنتیکی گیاهان زراعی به توسعه و جمع آوري منابع ژنتیکی وحشی، واریتههاي قدیمی و استفاده از روشهاي اصلاحی مدرن وابسته است. که این مراحل نیازمند ارزیابی دقیق تنوع ژنتیکی در یک سطح مشخص جهت گزینش براي مقاومت و واریتههاي پرعملکرداست . - 4 - از نشانگرهاي مولکولی مختلفی براي ارزیابی تنوع ژنتیکی در یونجه استفاده شده است. اخیرا نشانگرهاي ملکولی مبتنی بر رتروترنسپوزون ها معرفی شده اند که گستردگی، توزیع وسیع و تصادفی آنها در ژنوم و کروموزومهاي گیاهی و چندشکلی درجی آنها در بین و داخل گونههاي گیاهی، استفاده از آنها را به عنوان نشانگرهاي ملکولی براي انجام مطالعات مختلف از جمله ارزیابی تنوع ژنتیکی، انگشت نگاري ژنوتیپ ها، تعیین روابط تکاملی و حتی تهیه نقشه هاي پیوستگی بسیار ایدهآل میسازد . - 5 -
پروسجو و همکاران - 2002 - از نشانگر رتروترنسپوزونی 1SSAP مبتنی بر رتروترنسپوزونTms1Ret1 جهت مطالعه تنوع ژنتیکی در یونجه استفاده کردند وشاخص نشانگري زیادي را در این نشانگرها گزارش کردند. نشانگرهاي رتروترنسپوزونی 2IRAP برخلاف نشانگرهاي SSAP به برش هاي آنزیمی نیاز ندارند، با این حال تا کنون گزارشی مبنی بر استفاده از آنها در یونجه یافت نشده است. از این رو در این مطالعه براي اولین بار از نشانگرهاي IRAP جهت مطالعه ي تنوع ژنتیکی در یونجه استفاده شد
موادوروشها:
ده گیاه از هر کدام از جمعیت هاي قره یونجه ارومیه، قره یونجه ملک کندي، محلی اصفهان، بغدادي، همدانی، آذربایجان اردوبار، ترکیه ا و ترکیه ساکوئل انتخاب شدند واز برگ هاي 25 روزه آنها DNA ژنومی به روش آسوبل و همکاران با تغییرات جزئی استخراج شد. پنج تک آغازگر و 10 ترکیب آغازگري IRAP حاصل از خانواده هاي رتروترنسپوزونی Tms1Ret1 - از - M. sativa، LORE1 و LORE2 - از - Lotus japonicus، Tps12a و Tps19 - از - Pisum sativum براي بررسی تنوع ژنتیکی 8 جمعیت یونجه استفاده شد. برنامه دمایی واکنش زنجیره اي پلیمراز، الکتروفورز و رنگ آمیزي فرآورده هاي تکثیري طبق روش عبدالهی و همکاران - 1 - صورت گرفت با این تفاوت که دماي اتصال براي آغازگرها از 55 تا 63 درجه سانتیگراد متغیر بود. ماتریس وجود و عدم وجود باند 1 - و - 0 براي محاسبه ضرایب فاصله ژنتیکی نی بین جمعیت ها استفاده گردید. تجزیه واریانس ملکولی - Analysis of - AMOVA - molecular variance - میانگین هتروزیگوسیتی و درصد مکان هاي چندشکل براي هر جمعیت با استفاده از نرم افزار GenALEx6 نسخه 6 محاسبه شد. رسم دندروگرام و تجزیه کلاستر با روش UPGMA مبتنی بر ضرایب فاصله ژنتیکی نی با استفاده از نرم افزار NTSYS نسخه 2/02 انجام گرفت.
نتایج وبحث
پنج آغازگر منفرد و 10 ترکیب آغازگري IRAP - از خانوادههاي رتروترنسپوزونی مختلف - براي بررسی تنوع ژنتیکی 8 جمعیت یونجه مورد استفاده قرار گرفت که از این تعداد 10 آغازگر قادر به تولید الگوي باندي قابل نمره دهی بودند - جدول. - 1 از بین آغازگرهاي استفاده شده ترکیب آغازگري Tms1 Ret1 – LOR1 بیشترین تعداد نوار و بیشترین تعداد نوارهاي چند شکل را تولید کرد - شکل. - 1 ایجاد الگوي باندي مناسب بوسیله ترکیبات آغازگري در این مطالعه بیانگر این است که خانواههاي رتروترنسپوزونی در ژنوم یونجهدر نزدیکی هم درج شدهاند و یا در داخل همدیگر ادغام شدهاند. 10 آغازگر از 15 آغازگر استفاده شده در کل 101 مکان را تکثیر کردند که از این تعداد 66 مکان چند شکل بودند.
اندازه باندهاي تولید شده نیز از 200 جفت بازتا 3000 جفت باز متغیر بود. درصد مکانهاي چند شکل در جمعیت از 74/24 - همدانی - تا 89/39 - بغدادي - متغیر بود و میانگین آن برابر 82/01 بود. میانگین هتروزیگوستی جمعیتها نیز از 0/208 - جمعیت همدانی - تا 0/261 - جمعیت قره یونجه ملک کندي - متغیر بود و میانگین آن برابر 0/238 بودبر اساس ضرایب فاصله ژنتیکی نی، فاصله ژنتیکی جمعیت ها از 0/063 - قره یونجه ملک کندي و ترکیه ساکوئل - تا 0/151 - ترکیه ساکوئل و آذربایجان اردوبار - متغیر بود. و میانگین آن در بین جمعیتهاي مورد مطالعه برابر 0/11 بود. تجزیه کلاستر به روش UPGMA وبر اساس ضرایب فاضله ژنتیکی نی جمعیت هاي مورد مطالعه را در سه گروه اصلی قرار داد - شکل - 2
