بخشی از مقاله
چکیده
گل راعی گیاه دارویی مهمی بوده که در سرتاسر دنیا به خاطر خواص دارویی مصرف می شود. حصول به یکنواختی بالا در این گیاه یکی از اهداف اصلاحی می باشد. یکی از طرق رسیدن به یکنواختی ایجاد جنین سوماتیکی در این گیاه است. بدین منظور ریزنمونه های برگ این گیاه در محیط کشت MS به همراه با غلظت های مختلف 2,4-D 0 - ، 0/5، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - Kin، 0/5، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - کشت شدند.
کالوس های ایجاد شده بعد از یک ماه به محیط تولید جنین سوماتیکی که حاوی غلظت های مختلف هورمون 0 - NAA، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - BAP، 1و 2 میلی گرم در لیتر - بود، انتقال داده شدند. نتایج نشان داد که بیشترین درصد تولید کالوس جنین زا در محیط کشت MS به همراه با 1 میلی گرم در لیتر 2,4-D و 2 میلی گرم در لیتر Kin تولید شد. همچنین بیشترین درصد تولید جنین سوماتیکی در محیط کشت MS به همراه با 2 میلی گرم NAA و 1 میلی گرم BAP تولید شد.
.1 مقدمه
گل راعی گیاهی است پیچینده و برگی که در بسیاری از مناطق معندله دنیا رشد می کند. استفاده از این گونه به عنوان گیاه دارویی برای درمان بسیاری از بیماری ها به زمان یونان باستان باز می گردد. گل راعی تعداد زیادی مواد فعال از نظر زیستی تولید می کند که دو ماده هیپرسین - Hyprecin - و هیپرفورین - Hyperforin - دارای بیشترین فعالیت می باشد. سایر ترکیبات مانند کورسیتین - quercetin - و کمپفرول - kaempferol - همچنین به نظر می رسد که دارای فعالیت دارویی می باشد.
گل راعی دارای خواص آنتی باکتریایی، ضد افسردگی، ضدسرطانی، ضد ویروسی - اسکمپ و همکاران، - 1999، آنتی اکسیدانتی - لو و همکاران، - 2004 می باشد. در سال های اخیر، برنامه های اصلاحی با گل راعی آغاز گشته است - گادین و همکاران، . - 2000 مشابه با کلیه محصولات، به غیر از عملکرد بالا و سطح قابل پذیرش مقاومت، سطح بالایی از یکنواختی مواد گیاهی مورد نیاز می باشد. یکی از راه حل ها برای ایجاد یکنواختی در ماده خام، توسعه سیستم های درون شیشه ای مانند جنین سوماتیکی برای تولید این گیاه است.
در جنین زایی سوماتیک مجموعه ای از سلول های غیرجنسی، تشکیل جنین می دهند. این جنین ها شبیه جنین های زایگوتی بوده و در محیط کشت مناسب می توانند به نهال تبدیل شوند. باززایی گیاهان با استفاده از یک سلول، در بسیاری از گونه های گیاهان دارویی به اثبات رسیده است - ابراهیمی و همکاران، 2003 و ولی زاده و همکاران، . - 2009 لذا هدف از این تحقیق تولید جنین سوماتیکی با استفاده از ریزنمونه برگ در گیاه گل راعی بوده تا به گیاهان یکنواخت از نظر ژنتیکی دست یابیم.
.2 مواد و روش ها
بذور گل راعی توده های بومی اردبیل از موسسه تحقیقات جنگل ها و مراتع کشور تهیه شد. ابتدا این بذور با استفاده از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت بیست دقیقه ضدعفونی شدند. سپس بذور سه بار با آب مقطر شسته شدند. بذور ضدعفونی شده به گلدان های حاوی ماسه استریل منتقل شدند. پس از جوانه زدن و تشکیل گیاهچه، برگ های آن از گیاه جدا شد و در کلرومرکوریک %0/1 به مدت یک دقیقه ضدعفونی شده و سپس با آب مقطر استریل سه بار شستشو داده شدند.
ریزنمونه های برگ در داخل هود لامینار ضدعفونی شده به قطعات 2 میلی متری بریده شد و در محیط کشت MS به همراه با هورمون های 0 - 2,4 -D، 0/5، 1 و 2 میلی گرم بر لیتر - و 0 - Kin، 0/5، 1 و 2میلی گرم بر لیتر - کشت شدند. پس از ایجاد کالوس، کالوس های به دست امده به محیط تولید جنین سوماتیکی منتقل شدند که محیط کشت MS به همراه با غلظت های مختلف هورمون 0 - NAA، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - BAP، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 30 گرم در لیتر ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار بود. درصد تولید جنین سوماتیکی یک ماه پس از کشت یادداشت شد. آزمایشدر قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. برای آنالیز داده ها از نرم افزار SAS.9.1 استفاده شد. داده ها قبل از آنالیز نرمال شده و سپس تجزیه و تحلیل شدند.
.3 نتایج
درصد ریزنمونه های تولید کننده کالوس به طور معنی داری تحت تاثیر نوع تنظیم کننده های رشد گیاهی و اثرات متقابل این عوامل قرار گرفت. 7 روز پس از کشت، ریزنمونه ها شروع به تولید کالوس کردند. کالوس های تولید شده از لحاظ مورفولوژیکی به دو دسته کالوس هایی که دارای رنگ سفید متمایل به زرد و بافتی گرانوله - کالوس های نوع اول - و کالوس هایی که دارای رنگی قهوه ای روشن با بافتی آبکی یا نرم - کالوس های نوع دوم - بودند، تقسیم شدند - شکل . - 1 نتایج نشان داد که فقط کالوس های نوع اول پس از انتقال به محیط تمایزیابی، جنین سوماتیکی ایجاد کردند - کالوس جنین زا - . بیشترین درصد کالوس نوع اول در محیط کشت MS به همراه با 1 میلی گرم در لیتر 2,4-D به همراه با 2 میلی گرم در لیتر Kin به دست آمد - جدول . - 1
6 هفته پس از کشت ریزنمونه های برگ و برگ لپه ای، کالوس های تولید شده به محیط جنین زایی منتقل شدند. حدود دو هفته بعد از انتقال به محیط های تولید جنین سوماتیکی، جنین های کروی ریزی ظاهر شدند. از لحاظ مورفولوژیکی جنین های بدست آمده دارای مراحل کروی، قلبی و اژدری شکل بودند. جنین های کروی پس از دو هفته به مرحله قلبی و در نهایت یک ماه پس از کشت در محیط تمایز به مرحله اژدری رسیدند.
هیچ نوع اختلاف مورفولوژیکی بین جنین های ایجاد شده در محیط کشت های مختلف با ریزنمونه متفاوت مشاهده نشد. بیشترین درصد جنین زایی در محیط کشت MS به همراه با 2 میلی گرم در لیتر NAA و 1 میلیگرم در لیتر BAP و کمترین درصد جنین زایی در محیط کشت MS بدون هورمون بدست آمد - جدول . - 2 در کلیه تیمارهای اعمال شده جنین سوماتیکی تولید شد، اما بازدهی تولید جنین سوماتیکی با نوع تنظیم کننده رشد گیاهی و غلظت آن و نوع محیط کشت متفاوت بود.
.4 بحث
این مطالعه اولین گزارش تولید جنین سوماتیکی در گیاه گل راعی H. perforatum است. نتایج این تحقیق نشان داد که نوع ریزنمونه، نوع مواد تنظیم کننده رشد گیاهی و اثرات متقابل این عوامل به طور معنی داری درصد ریزنمونه های تولید کننده کالوس را متاثر نمود. اکسین ها و سایتوکنین ها دو گروه از تنظیم کننده های رشد گیاهی هستند که ثابت شده است نقش مهمی در جنین زایی سوماتیک و اندام زایی دارند - فهر و همکاران، . - 2001 این مطابق با یافته های این مطالعه است که مشخص شد این دو تنظیم کننده رشد گیاهی در القاء کالوس های جنین زا و جنین سوماتیکی نقش مهمی را دارند. نتایج این تحقیق نشان داد که کالوس هایی که در محیط کشت به همراه 2,4-D و BAP تولید شدند، بیشتر از نوع اول بودند که مطابق با نتایج سایر مطالعات ناتاشا و همکاران - 2014 - و لین و همکاران - 2011 - است، آنها که مشاهده کردند ترکیبی از 2,4-D و سایتوکنین برای القاء کالوس جنین زا موثرتر می باشد.
.5 نتیجه گیری کلی
به طور کلی نتیجه گرفته شد که محیط کشت MS به همراه با 1 میلی گرم در لیتر 2,4-D و 2 میلی گرم در لیتر Kin بهترین نتیجه برای تولید کالوس جنین زا و محیط کشت MS به همراه با 2 میلی گرم در لیتر NAA و 1 میلی گرم در لیتر BAP بهترین نتیجه را برای تولید جنین سوماتیکی ایجاد می کند.
