بخشی از مقاله
چکیده
گل راعی یکی از مهمترین گیاهان دارویی بوده که در سرتاسر جهان به دلیل خواص دارویی بی نظیرش مصرف می شود. از اهداف اصلاحی این گیاه حصول به یکنواختی بالا، افزایش ماده موثره و عملکرد می توان اشاره نمود. یکی از راهکارهای ا صلاحی ا ستفاده از ابزارهای ک شت بافت در کنار تکنیک های سنتی ا صلاح نباتات بوده که می تواند با کاهش دوره ر شد، کمک شایانی به اصلاح گیاه نماید.
این تحقیق با هدف تولید جنین سوماتیکی در گیاه گل راعی انجام شد. بدین منظور ریزنمونه های ساقه این گیاه برای تولید کالوس جنین زا در محیط کشت MS به همراه با هورمون های مختلف 2,4-D 0 - ، 0/5، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - Kin، 0/5، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - کشت شدند. کالوس های ایجاد شده برای تولید جنین سوماتیکی به محیط کشت MS به همراه با هورمون های 0 - NAA، 1، 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - BAP، 1 و 2 میای گرم در لیتر - انتقال داده شدند. نتایج نشان داد که بهترین محیط کشت برای تولید کالوس جنین زا محیط کشت MS به همراه با 0/5 میلی گرم در لیتر 2,4-D و 0/5 میلی گرم در لیتر Kin می باشد. بهترین محیط کشت برای تولید جنین سوماتیکی محیط کشت MS به همراه با 2 میلی گرم در لیتر NAA و 2 میلی گرم BAP بود.
.1 مقدمه
گل راعی با نام علمی Hypericum perforatum گ یاهی خشبی، چ ند سا له و متعلق به تیره گل راعی Hypericaceae می باشد. این گیاه در مناطق معتدله اروپا و آسیا می روید. در ایران در نواحی شمالی به خصوص اردبیل، آستارا و گرگان به صورت خودرو در مراتع دیده می شود. گل راعی گیاه دارویی ارزشمندی است که در طب سنتی از دو هزار سال قبل مورد استفاده قرار می گرفته است. اخیراً شواهد کلینیکی و فارموکولوژیکی نشان داده اند که این گیاه دارای اثرات ضد ویروسی، ضد افسردگی، مسکن اعصاب، ضدعفونی کننده، ضد التهاب و التیام بخش می باشد.
چنین خواصی به ترکیب ویژه ای به نام هیپرسین نسبت داده می شود. علاوه بر این، از این گیاه در درمان سوختگی ها، ترمیم زخم ها و درمان بی خوابی ا ستفاده می شود. بی شتر گیاهان دارویی به طور وح شی در طبیعت می رویند. بهره برداری غیر صحیح و بی رویه از زی ستگاههای طبیعی علاوه بر اینکه میزان تولید سنتی آنها را پایین آورده ا ست، این منابع با ارزش گیاهی را بیشتر در معرض خطر انقراض قرار داده است.
از طرفی بیشتر گیاهان دارویی با استفاده از روش های مرسوم قابل تولید نمی باشند، بنابراین استفاده از روش های بیوتکنولوژی از جمله کشت بافت و سلول گیاهی به منظور تکثیر انبوه و همچنین افزایش توان ژنتیکی آنها برای تولید ترکیبات دارویی مهم، تولید گیاهان یکنواخت از نظر ژنتیکی و حفظ ذخایر ژنتیکی باارزش و در حال انقراض می تواند بسیار مفید و از لحاظ تجربی بسیار سودمند باشد - سوود و چاهان . - 2009 یکی از راههای کوتاه کردن طول دوره رشد و تولید گیاهان دارویی در مقیاس وسیع و تجاری تولید و توسعه جنین های سوماتیکی یا غیرجنسی از طریق کشت بافت است.
در جنین زایی سوماتیک مجموعه ای سلول های غیرجنسی، تشکیل جنین می دهند. این جنین ها شبیه جنین های زایگوتی بوده و در محیط کشت مناسب می توانند به نهال تبدیل شوند. باززایی گیاهان با استفاده از یک سلول، در بسیاری از گونه های گیاهان دارویی به اثبات رسیده است - ابراهیمی و همکاران 2003 و ولی زاده و همکاران . - 2009 جنین زایی سوماتیکی نه فقط برای تولید گیاهان و تولید متابولیت های ثانویه مهم است، بلکه برای ایجاد گیاهان تراریخته دارای اهمیت ویژه ای است. لذا هدف از انجام این تحقیق بررسی قابلیت تولید جنین سوماتیکی در گیاه گل راعی می باشد.
.2 مواد و روش ها
از موسسه تحقیقات جنگل ها و مراتع کشور بذور گل راعی توده های بومی اردبیل تهیه شد. ابتدا این بذور شسته شد و سپس با استفاده از هیپوکلریت سدیم 2 درصد به مدت بیست دقیقه ضدعفونی شدند. پس از ضدعفونی سه بار با آب مقطر استریل بذور شسته شدند. بذور ضدعفونی شده به گلدان های حاوی ماسه استریل منتقل شدند. پس از جوانه زدن و تشکیل گیاهچه، ساقه ها در کلرومرکوریک %0/1 به مدت یک دقیقه ضدعفونی شده و سپس با آب مقطر استریل سه بار شستشو داده شدند.
ریزنمونه های ساقه در داخل هود لامینار استریل شده به قطعات 5 میلی متری بریده و در محیط کشت MS به همراه با هورمون های 0 - 2,4 -D، ، 0/5، 1 و 2 میلی گرم بر لیتر - و 0 - Kin، 0/5، 1 و 2میلی گرم بر لیتر - کشت شدند. پس از چهار هفته، کالوس های به دست امده به محیط کشت MS به همراه با غلظت های مختلف هورمون 0 - NAA، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 0 - BAP، 1 و 2 میلی گرم در لیتر - و 30 گرم در لیتر ساکارز و 8 گرم در لیتر آگار منتقل شدند. درصد تولید جنین سوماتیکی یک ماه پس از کشت یادداشت شد. آزمایشدر قالب طرح کاملاً تصادفی انجام شد. برای آنالیز داده ها از نرم افزار SAS.9.1 استفاده شد. داده ها قبل از آنالیز نرمال شده و سپس تجزیه و تحلیل شدند.
.3 نتایج
10 روز پس از کشت ریزنمونه ها، کالوس زایی شروع شد. در طی مدت یک ماه اکثر ریزنمونه ها کالوس تولید کردند. بر اساس خصوصیات مرفولوژیکی کالوس های تولید شده به دو گروه کالوس های نوع اول که کالوس هایی با رنگ سفید و مایل به زرد و کالوس های نوع دوم که کالوس های قهوه ای تیره رنگ بودند، تقسیم بندی شدند. در نتایج ما فقط کالوس های نوع اول هنگام انتقال به محیط تمایز یابی جنین سوماتیکی تولید کرد - شکل . - 1
ایجاد کالوس جنین زا - نوع اول - - A - و جنین های سوماتیکی تولید شده در گیاه گل راعی . - B -
نتایج نشان داد که تولید کالوس جنین زا به غلظت هورمون های موجود در محیط کشت بستگی دارد. همچنین مشخص شد که افزودن 2,4-D برای ایجاد کالوس در محیط کشت ضروری بوده به طوریکه در محیط کشت فاقد این هورمون هیچ کالوسی تولید نشد. با این حال، زمانی که از ترکیب هورمون 2,4-D و Kin استفاده می شد، کالوس جنین زا تولید شد. در محیط کشت MS به همراه با 0/5 گرم در لیتر 2,4-D و 1 گرم در لیتر Kin بیشترین درصد تولید کالوس جنین زا بدست آمد - جدول . - 1 در محیط کشت فاقد هورمون هیچ کالوسی تولید نشد و ریزنمونه ها پس از مدتی سیاه شده و از بین رفتند.
کالوس های تولید شده به منظور تولید جنین سوماتیکی به چهار نوع محیط کشت مختلف با غلظت های متفاوت هورمونی منتقل شدند. سه هفته پس از انتقال جنین های کروی بر روی کالوس ها مشاهده شدند. تولید جنین های سوماتیکی در این تحقیق دارای مراحل مورفولوژیکی کروی، قلبی و اژدری شکل بود. جنین های کروی حدود دو هفته بعد به جنین قلبی شکل و در مدت یک ماه به جنین اژدری توسعه پیدا کردند. نتایج در این مرحله نشان داد که بیشترین درصد تولید جنین سوماتیکی در محیط کشت MS به همراه با 2 میلی گرم در لیتر NAA و 2 میلی گرم در لیتر BAP به دست امد.
همچنین جنین های غیر طبیعی در ارقامی که در محیط کشت های مختلف کمترین تولید جنین سوماتیکی را داشتند، مشاهده شد. این جنین ها بیشتر از لحاظ تولید لپه دچار مشکل بودند، بطوریکه در مواردی فاقد یک لپه و گاهی دارای چند لپه بودند که این جنین ها در مرحله تولید گیاهچه از لحاظ تولید ریشه و شاخساره دچار مشکل می شدند. رابطه مثبتی بین درصد تولید کالوس جنین زا و درصد تولید جنین سوماتیکی وجود داشت، بطوریکه ارقامی که بیشترین درصد تولید کالوس جنین زا را داشتند، بیشترین درصد تولید جنین سوماتیکی را نیز داشتند.
.4 بحث
گزارش حاضر اولین گزارش تولید کالوس جنین زا و جنین سوماتیکی از ریزنمونه ساقه در گیاه گل راعی می باشد. در اکثر گزارش ها در مرحله تولید کالوس جنین زا، هورمون 2,4-D به عنوان موثرترین هورمون جهت تولید کالوس جنین زا بیان شده است - اولاهه و همکاران 2009، گامبینو و همکاران . - 2007 در این تحقیق نیز موثر بودن این هورمون برای هدف القای کالوس جنین زا تصدیق شد که احتمالا بدلیل خاصیت استرس زا بودن این ماده باشد که محرکی برای تولید کالوس جنین زا است.
