بخشی از مقاله
مقدمه
تنظیم ترشح انسولین از سلولهای بتا میتواند از راههای متفاوتی از جمله تغییر غلظت گلوکز خون، هورمونهای مختلف و میانجیهای عصبی انجام شود که مسیر انتقال پیام درونسلولی هر کدام متفاوت است.۲،۱ در سالهای اخیر تنظیم پاراکرین فعالیت سلولهای B مورد تأکید قرار گرفته
است. از جمله ترکیباتی که به عنوان عامل پاراکرین و
اتوکرین در تنظیم فعالیت سلولهای B پیشنهاد شده، گاما آمینو بوتیریک اسید (GABA) است. گابا به طور عمده در نورونها و سیستم عصبی مرکزی (CNS)۴،۳ که اثر مهاری
دارند، یافت میشود اگرچه در برخی بافتها اثر تحریکی آن نیز گزارش شده است.۵ وجود این میانجی در بافتهای دیگر مانند پانکراس نیز گزارش شده است.۶ مطالعههای ایمنوسیتوشیمی نشان داده که گابا و آنزیم سنتزکنندهی آن یعنی گلوتامات دکربوکسیلاز (GAD) در سلولهای B و
۰۶ مجلهی غدد درونریز و متابولیسم ایران دورهی دهم, شمارهی ۱، اردیبهشت ۷۸۳۱
همچنین سلولهای A وجود دارد.۲۱-۷ مشخص شده که گابا در CNS دارای سه نوع رسپتور میباشد که دو نوع رسپتور آن جزﺀ گیرندههای مؤثر آیونورسپتورها ( GABAA,
(GABAC و نوع دیگر جزﺀ متابورسپتورها (GABAB) است.۴۱،۳۱ وجود رسپتورهای GABAB و همچنین بیان ﮊن
آن در سلولهای بتا نیز به اثبات رسیده است.۵۱ گابا و انسولین با تحریک سلولهای بتای پانکراس توسط گلوکز از سلولهای B به طور همزمان آزاد میشوند.۶۱ یافتهها در
مورد اثر تنظیمی گابا بر ترشح انسولین متناقض هستند. برخی گزارشها نشان دادهاند که گابا ترشح انسولین و گلوکاگون را کاهش میدهد.۷۱ مطالعهای که روی پانکراس پرفیوز شدهی موش صحرایی و سگ انجام شد، نشان داد که گابا موجب کاهش ترشح انسولین میشود،۹۱،۸۱ در حالی که مطالعههای دیگر پیشنهاد میکنند که گابا روی ترشح انسولین در پانکراس پرفیوﮊ شده موش صحرایی اثری ندارد.۱۱،۳ در رابطه با مکانیسم اثر گابا روی سلول B نیز
توافق کاملی وجود ندارد. برخی مطالعهها گزارش کردهاند که گابا از طریق رسپتور GABAB اثر میکند.۰۲ در حالی که بیان ﮊن رسپتور GABAA نیز در سلولهای B گزارش شده
است.۱۲
با توجه به این که هنوز اثر GABA در ترشح انسولین
قطعی نشده است، مطالعهی حاضر با هدف بررسی اثر گابا روی ترشح انسولین از جزایر لانگرهانس تحریک شده توسط گلوکز و اثر آگونیست (باکلوفن) و آنتاگونیست (ساکلوفن) اختصاصی رسپتور GABAB انجام شد.
مواد و روشها
در این مطالعه از ۵۴ سر موش صحرایی نر نژاد ویستار در محدودهی وزن ۰۵۲-۰۰۲ گرم تهیه شده از حیوانخانهی دانشگاه علوم پزشکی بقیه ا... (عج) استفاده شد. حیوانات در شرایط دمای ۲±۲۲ درجهی سانتیگراد و چرخهی نوری ۲۱ ساعت نور و ۲۱ ساعت تاریکی در حیوانخانهی پژوهشکدهی غدد درونریز و متابولیسم نگهداری شدند. حیوانات به آب و غذا (خوراک موش تهیه شده از شرکت خوراک دام پارس، ایران) دسترسی آزاد داشتند.
برای جداسازی جزایر لانگرهانس از تکنیک هضمی کلاﮊناز استفاده شد.۲۲ به طور خلاصه، پس از بیهوشی با اتر، سر حیوان جدا و پس از تخلیهی کامل خون از بدن
ناحیهی شکم باز شد. پس از مسدود کردن محل ورود مجرای مشترک صفراوی به دوازدهه از طریق یک کاتتر باریک (شمارهی ۸۱) ۰۱ میلیلیتر محلول نمکی هنکس i(HBSS) سرد )]کلریدسدیم ۶۳۱، کلریدپتاسیم ۶۳/۵، کلرید
کلسیم ۶۲/۱، سولفات منیزیم ۱۸/۰، فسفاتدیسدیم هیدروﮊن ۳۳/۰، فسفات دیهیدروﮊن پتاسیم ۴۴/۰ و بیکربنات سدیم ۶۱/۴ (بر حسب میلیمول)[۳۲ حاوی ۵/۰ میلیگرم در میلی لیتر کلاﮊناز P – (شرکت Roche، آلمان) به
داخل مجرای مشترک صفراوی تزریق شد.۴۲ با تزریق محلول حاوی کلاﮊناز، پانکراس متسع شده بلافاصله از بدن حیوان خارج و پس از جدا کردن بافتهای چربی و غدد لنفاوی، به درون لولهی فالکون پلاستیکی که حاوی ۵ میلیلیتر هنکس و کلاﮊناز منتقل و به مدت ۷۱ دقیقه در دمای ۷۳ درجه سانتیگراد در بنماری قرار داده شد.۵۲ در انتهای زمان انکوباسیون، محتویات لوله با استفاده از هنکس سرد به حجم نهایی ۵۳ میلی لیتر رسانده و لوله به مدت ۱ دقیقه با دست تکان داده شد. محتویات به داخل کریستالیزور (حجم۰۵۱ میلیلیتر) منتقل، هنکس سرد تا لبهی کریستالیزور اضافه و محتویات کریستالیزور به آرامی مخلوط شد. پس از گذشت ۰۹ ثانیه، محلول فوقانی توسط ساکشن تخلیه و عمل شستشو ۲ بار دیگر تکرار میشد. سوسپانسیون نهایی از صافی (با منافذ ۰۰۵ میکرومتر) عبور داده شده، دوباره با هنکس سرد شسته شد. رسوب باقی مانده که حاوی جزایر لانگرهانس جدا شده است درون سینی یخ قرار داده شد و با استفاده از استریو میکروسکوﭖ ( Kyowa مدل-SDZ-TR PL، ﮊاپن) و به کمک پیپت پاستور شیشهای جزایر جدا و به
درون پتری دیش دیگری منتقل شد.۶۲
با استفاده از پیپت پاستور زیر استریومیکروسکوﭖ هشت عدد از جزایر جدا و به هر یک از کاﭖهای واقع در سینی یخ منتقل شد. پس از خارج کردن محلول هنکس به کاﭖهای حاوی جزایر، ۱ میلی لیتر محلول کربس ]حاوی کلرید سدیم (۵۱۱)، کلرید پتاسیم (۵)، کلرید منیزیم (۱)، کلرید کلسیم (۵/۲)، بیکربنات سدیم (۴۲) (شرکت Merck، آلمان)
HEPES ۶۱ (شرکت Sigma، امریکا) (بر حسب میلیمول) و ۵/۰ گرم در دسیلیتر آلبومین گاوی (شرکت Sigma،
امریکا)[ اضافه شد.۷۲ محلول کربس در آزمایشهای مختلف
دارای غلظتهای مختلف گلوکز و آگونیستها و
i- Hank’s Balanced Salt Solution
فرزانه فرجی و همکاران اثر مهاری گابا بر ترشح انسولین ۱۶
آنتاگونیستهای گابا (گابا، باکلوفن و ساکلوفن) (شرکت Sigma، امریکا) بود (گلوکز، گابا، آگونیست و آنتاگونیست
گابا همزمان اضافه شدند). کاﭖها به محفظهی شیشهای که درب آن توسط درپوش پلاستیکی بسته میشد منتقل و در حمام ۷۳ درجهی سانتیگراد انکوبه شدند و در پنج دقیقهی اول انکوباسیون جزایر در معرض گاز کربوﮊن (۵۹% اکسیژن و ۵% گاز کربنیک) قرار گرفتند. بعد از پایان مدت انکوباسیون که برای آزمایشهای مختلف مدت آن متغیر بود ( ۰۱، ۰۲، ۰۴، ۰۵، ۰۶ و ۰۹ دقیقه) محلول رویی با استفاده از پیپت پاستور جدا، به میکروتیوﭖ منتقل و تا زمان اندازهگیری در دمای ۰۷- درجهی سانتیگراد نگهداری شد. برای هر بار آزمایش، از هر غلظت ۵ کاﭖ گذاشته شد که در مجموع هر غلظت ۵۲ بار تکرار شد.
انسولین با روش الایزا توسط کیت اختصاصی انسولین موش صحرایی موش صحرایی (شرکت Mercodia، سوئد)
اندازهگیری شد. ضریب تغییرات درونسنجی و برونسنجی روش به ترتیب ۰/۶ و ۷/۹ درصد بود.
یافتهها به صورت میانگین ± خطای استاندارد میزان انسولین ترشح شده از جزایر (میکرویونیت از هر جزیره لانگرهانس در واحد زمان) بیان شده است. با استفاده از نرمافزار SPSS برای بررسی وجود اختلاف معنیدار بین
زمانهای مختلف انکوباسیون از آنالیز واریانس دو طرفه و به منظور بررسی اختلاف بین نمونههای واجد یا فاقد آگونیست یا آنتاگونیست گابا از آنالیز واریانس یک طرفه به همراه آزمون توکی استفاده شد. مقدار p کمتر از ۵۰/۰ معیار
معنیدار بودن تفاوتها در نظر گرفته شد.
یافتهها
ترشح انسولین در زمانهای متفاوت انکوباسیون:
میزان ترشح انسولین در زمانهای مختلف انکوباسیون در دو غلظت گلوکز (۳/۸ و ۷/۶۱ میلیمولار) نشان میدهد که ترشح انسولین هم وابسته به دوز و هم وابسته به زمان است به طوری که میزان ترشح انسولین در حضور غلظت ۳/۸ میلیمولار گلوکز در زمانهای انکوباسیون ۰۱، ۰۲، ۰۴، ۰۶ و ۰۹ دقیقه (که به ترتیب ۸/۰±۵۲/۲، ۸/۰±۵۳/۰، ۷۸/۱±۷۹/۲۱، ۶۹/۲±۷۶/۶۳ و ۴/۳±۸۹/۶۳ میکرو یونیت به ازای جزیره در دقیقه بود) در مقایسه با حضور غلظت ۷/۶۱ میلیمولار گلوکز (که به ترتیب ۹۵/۱±۷۷/۴، ۷۹/۱±۳۸/۶،
۲۷/۳± ۸۲/۱۴، ۴۷/۷±۵/۰۰۱ و ۹۲/۶±۴۲/ ۲۰۱ میکرویونیت به ازای جزیره در دقیقه بود) اختلاف معنیداری را نشان داد (در زمان ۰۲ دقیقه ۵۰/۰ p< و در زمانهای ۰۴، ۰۶ و ۰۹ دقیقه ۱۰۰/۰ (p< (نمودار ۱). همچنین مقایسهی میزان ترشح
انسولین از جزایر لانگرهانس در زمانهای انکوباسیون مختلف در حضور هر یک از غلظتهای گلوکز (۳/۸ و ۷/۶۱ میلیمولار)، اختلاف معنیداری را نشان داد (برای زمانهای ۰۴، ۰۶ و ۰۹ دقیقه در مقایسه با زمان ۰۱ دقیقه ۱۰۰/۰(p<
(نمودار ۱).
٭† ٭† 120 (uU/islet/min)
Glucose 8.3 mM 100
Glucose16.7 mM
80
٭† 60 put
40 out
Insulin
٭ 20
0
90 60 40 20 10
Time (min)
نمــودار ۱- ترشــح انــسولین از جزایــر لانگرهــانس در زمانهای مختلف انکوباسیون در حضور غلظت های۳/۸ و ۷/۶۱ میلیمولار گلـوکز .( ٭: تفـاوت معنـیدار نـسبت بـه غلظــت ۳ /۸ میلــیمــولار گلــوکز (۵۰ /۰ (p< و :† تفــاوت معنـیدار نــسبت بــه زمـان ۰۱ دقیقــه انکوباســیون ( ۱۰۰ /۰(p<
اثر گابا در زمانهای مختلف در حضورگلوکز: مقایسهی
اثر گابا در زمانهای۰۱، ۰۲، ۰۴، ۰۶ و ۰۹ دقیقه به طور جداگانه بر میزان ترشح انسولین از جزایر لانگرهانس در حضور غلظتهای مختلف گلوکز (۳/۸ و ۷/۶۱میکرو مولار) نشان داد که ترشح انسولین در حضور غلظت ۳/۸ میلیمولار گلوکز و ۰۵ میکرو مولار گابا در زمانهای ۰۱، ۰۲، ۰۴، ۰۶ و ۰۹ دقیقه به ترتیب ۷۱/۰±۶۳/۰، ۶۱/۰±۱۳/۰، ۷۸/۱±۷۹/۲۱، ۲۴/۲±۹۷/۱۳ و ۸۹/۲±۷۲/۱۳ (نمودار ۲) و برای ۷/۶۱ میلیمولار گلوکز در حضور ۰۵ میکرو مولار گابا ۳/۱±۹۲/۳، ۶۹/۰±۹۹/۲، ۱۳/۳±۲۸/۰۴، ۴۲/۶±۷۶/۸۷ و ۳۶/۶±۱۵/۳۰۱ میکرو یونیت به ازای جزیره در ۰۶ دقیقه بود (نمودار ۳). در این آزمون ترشح انسولین در حضور گابا (۰۵ میکرومولار) در مقایسه با حضور گلوکز (۳/۸ و ۷/۶۱ میلیمولار) به
۲۶ مجلهی غدد درونریز و متابولیسم ایران دورهی دهم, شمارهی ۱، اردیبهشت ۷۸۳۱
تنهایی در زمان ۰۶ دقیقه کاهش معنیداری را نشان داد
(۵۰/۰ ( p< (نمودارهای ۲ و ۳).
