بخشی از مقاله
چکیده
تکنیک امتزاج یا الحاق ژن - - Gene Fusion کاربردی بسیار وسیع در تحقیقات بیوتکنولوژی دارد. ساخت پروتئینهای الحاقی برای افزایش بیان پروتئینهای محلول و تسهیل تخلیص آنها از جمله مهمتربن کاربرد آن است، البته در سالهای اخیر کاربردهای زیادی برای آن بیان گردیده که شامل انتخاب و تولید آنتی بادیها و تولید آنزیمهای دوکاره - Bifunctional - Enzyme و پروتئینهای با عمل اختصاصی مانند یک پروتئین جهت شناسایی یک ژن خاص به کار رفته است. ساخت پروتئینهای الحاقی نیازمند طراحی توالی لینکر است.
انتخاب توالی لینکر بسیار مهم است تا یک پروتئین الحاقی با عملکردی مناسب حاصل گردد، اگرچه قانون کلی با استناد به لینکرهای طبیعی برای طراحی لینکرها را میتوان در نظر داشت. بهرحال لینکرها در بهبود فعالیت بیولوژیکی، افزایش عملکرد بیان، و دستیابی به پروفایل فارماکوکینتیک مطلوب، تأثیرگذارند.
.1 مقدمه
دستکاری ژنتیکی یکی از شاهکارهای بزرگ در علوم زیستی مولکولی بوده است. پروتئین الحاقی به عنوان یک محصول تکنولوژی DNA نوترکیب، در طبقه مولکولهای زیستی نوین با خواص چند منظوره توسعه یافته است. در زمینه های مختلف بیوتکنولوژی، نظیر مهندسی پروتئین و خالصسازی آن، دارورسانی هدفمند و ایمونولوژی کاربرد دارد. در این تکنیک با ترکیب ژنتیکی دو یا چند ژن با هم، پروتئین فیوژن حاصل میشود .
تولید پروتئین نوترکیب کایمر به افزایش بیان پروتئینهای محلول و جداسازی آنها کمک میکند . دسته وسیعی از کاربردهای تکنیک امتزاج ژن در زمینههای بیوتکنولوژی گزارش شده است که شامل سنجش ایمنی که از الحاق قطعات آنتی بادی یا بخشهای متصل شونده به آنتی-بادی بهره میگیرند، آنزیمها یا تنوعی از پروتئینهای فلوئورسنت که انتخاب و تولید آنتی بادی و مهندسی آنزیمهای دو عملکردی از کاربردهای آن است.
کاربردهای پروتئین الحاقی یا امتزاج ژن
- برای خالصسازی: اتصال توالی پلیپپتیدی به پروتئین که باعث خالصسازی پروتئین میشود، مثل اتصال توالی 6 تایی His tag به پروتئین که تمایل زیادی به نیکل دارد و در ستون نیکل به آن میچسبد و بعد با تغییر ph از ستوان جدا میشود، لذا از این طریق میتوان پروتئین خاص را از انبوه پروتئین بیان شده جداسازی کرد.
- رفع مشکل :Inclusion body زمانیکه بیان پروتئین از حد معمول بیشتر شود یا پروتئین دارای باندهای دیسولفیدی زیاد باشد، شکل سه بعدیشان از بین میرود و به هم میچسبند و به حالت نامحلول در میآیند که به این حالت Inclusion body میگویند، که برای حل این مشکل قبل از ژن یکسری توالیهایی قرار میدهند که میزان چسبندگی یا Inclusion body را کم میکند. یکی از این توالیها تیرودوکسین است که حالت احیاکنندگی دارد، در نتیجه unfolding را کم و محلولیت را زیاد میکند.
- بیان پروتئین در اندامکهای خاص: چنانچه بیان یک پروتئین در اندامک خاص هدف باشد به عنوان مثال تجمع پروتئین در واکوئل مدنظر باشد از سیگنال پپتید که توالی چندتایی هستند استفاده میشود. به عنوان مثال توالی رمزکننده اسید آمینههای KDEL - لیزین، اسید آسپارتیک، اسید گلوتامیک و لوسین - به ژن متصل شود که پس از بیان پروتئین به واکوئل منتقل میشود. یعنی در این حالت هدفمند شدن بیان مد نظر میباشد.
تکنیکهای امتزاج ژن
تکنیک پروتئین الحاقی و بیان نوترکیب بر سه روش اصلی استوار است. روش اولیه که رواج بیشتری دارد روش آنزیمی میباشد که بر استفاده آنزیمهای محدود کننده ایجاد گردیده است. روش دوم که روش SOEing PCR نامیده میشود - Splicing by Overlapping Extension PCR - که بر طراحی پرایمر و تکثیر PCR استوار می باشد. سومین روش نیز روش سنتتیک یا مصنوعی امتزاج ژن میباشد.
روش آنزیمی:
در روش آنزیمی ابتدا در مرحله طراحی پرایمر، طوری پرایمرها را طراحی میکنیم که ابتدای 5C ژن اول و انتهای 3C ژن دوم با دو آنزیم محدود کننده - Restriction enzyme - متفاوت برش زده شوند و انتهای3C ژن اول و ابتدای5C ژن دوم با یک آنزیم مشترک و متفاوت از دو آنزیم قبلی برش زده شوند. سپس ژنهای مورد نظر با روشهای مهندسی ژنتیک در وکتور مناسب کلونینگ - PUC - ، کلون میشوند و بعد از آن برای خارج کردن یکی از دو ژن از وکتور کلونیگ، از آنزیمهای محدود کننده نامبرده استفاده خواهد شد. سپس کدون پایانی ژن دیگر را توسط آنزیمهای محدود کننده حذف کرده، با قرار دادن این قطعات ژنی در کنار یکدیگر احتمال اتصال و امتزاج این دو ژن با یکدیگر بالا میرود. حال با استفاده از آنزیمهای محدود کننده که جایگاه برش - Restriction site - برای آنها در ابتدای5C ژن اول و انتهای3C ژن دوم قرار داده شد میتوان این قطعه را درآورده و در یک وکتور بیانی وارد نمود و تولید پروتئین داشت.
روش : SOEing PCR
روش دوم امتزاج ژن روش امتزاج توسط PCR میباشد . این روش را SOEing PCR نیز مینامند. در این مکانیسم به طراحی دقیق پرایمر نیاز است. پرایمر پیشرو - Forward - ژن دوم باید به گونهای طراحی شود که با پرایمر پسرو - Reverse - ژن اول همپوشانی داشته باشد. در این حال ابتدا دو ژن را تکثیر مینماییم و سپس محصول این دو تکثیر را در کنار هم قرار داده و تکثیر مجددی انجام میدهیم. در انتها محصول نهایی را مجددا با پرایمر Forward ژن ابتدایی و پرایمر Reverse ژن دوم تکثیر مینماییم تا به میزان مناسبی از محصول ژن ممزوج شده را داشته باشیم. در نهایت با برش آنزیمهای محدود کننده مناسب که در طراحی پرایمر آنها را قرار دادهایم این قطعه را برش زده و در وکتور مناسب کلون مینماییم.
روش سنتتیک یا مصنوعی:
روش سنتتیک سومین روش میباشد که در آن با استفاده از توالیهای ژنوم در سایتهایی مانند NCBI ، توالی های مورد نظر را دریافت نموده و با توجه به جایگاه برش آنزیمی موجود در داخل ژن در دو طرف ژنهای مورد نظر جایگاههای برش خاصی را قرار میدهیم. سپس توالی لینکر بین دو ژن را به انتهای 5C ژن ابتدایی اضافه میکنیم و در کنار توالی ژن دوم قرار میدهیم. این توالی ایجاد شده کامل را در مجموع جهت سنتز باید به مراکز سنتز ژن ارسال نماییم. توالی ارسال شده از شرکت سنتز کننده را با آنزیمهای محدود کننده مورد نظر، که در دو طرف ژن ها ایجاد کردهایم برش میزنیم و در وکتوری که با همین آنزیمها برش خورده کلون مینماییم
طراحی لینکرها - اتصال دهندهها -
ساخت موفقیت آمیز پروتئین الحاقی نوترکیب نیاز به دو عنصر ضروری دارد: پروتئینهای ترکیب شونده و لینکرها. انتخاب پروتئین ترکیب شونده بسیار ساده است اما انتخاب و طراحی لینکر اندکی دقیق و پیچیده است .[5] بنابراین، انتخاب یا طراحی منطقی لینکر برای اتصال دامین پروتئین الحاقی، مهم و در عین حال در فنآوری پروتئین الحاقی نوترکیب نامکشوف است . لینکرها به عنوان یک جزء ضروری از پروتئین نوترکیب، در ساختار پایدار و افزایش فعالیت زیستی اهمیت زیادی دارند.
