بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این پژوهش جداسازي باکتريهاي تولیدکننده فیتاز از شکمبه و اندازه گیري فعالیت آنها بود. فیتیک اسید یا فیتات فرم اصلی ذخیره اي فسفر در گیاهان می باشد. شکمبه نشخوار کنندگان منبع غنی از باکتري هاي تولید کننده فیتاز است که آنزیم آنها می تواند براي تجزیه فیتات گیاهی مورد استفاده در تک معده اي ها قرار بگیرد. براي جداسازي باکتريهایی با قابلیت فیتازي، مایع شکمبه جمع آوري شد و پس از صاف نمودن آن روي محیط کشت مخصوص باکتريهاي شکمبه حاوي سدیم فیتات بصورت بی هوازي در دماي 39درجه رشد داده شد. سپس رنگ آمیزي به روش آمونیوم مولیبدات در محیطهاي حاوي سدیم فیتات صورت گرفت و توانایی تولید آنزیم فیتاز روي محیط کشت اختصاصی تعیین شد.
فعالیت آنزیمهاي باکتريهاي منتخب در pH هاي مختلف سنجیده شد. از میان 40 باکتري جدا شده شده تعداد 22سویه توانایی تولید فیتاز را داشتند که بصورت هاله شفاف در اطراف کلنیها مشخص شد. اندازه گیري فعالیت آنزیمی این 22 گونه نشان داد که 6 گونه R1,R2,R3,R4,R5,R6 داراي بیشترین فعالیت آنزیمی بودند. حداکثر فعالیت آنزیمی براي اغلب آنها در 5/5 pH بود . با توجه فعالیت فیتازي سویه هاي R1,R2,R3,R4,R5,R6در pH هاي 4/5 و 5/5 استفاده از این باکتريها بصورت مکملهاي میکروبی در خوراك حیوانات تک معده اي پیشنهاد می شود.
مقدمه
فیتیک اسید - میواینوزیتول هگزاکیس - ديهیدروژن فسفات - - ، شکل ذخیره اي فسفاتی است که در دانه هاي غلات و دانه هاي روغنی یافت می شود - . - 6 بخش عمده اي از آن بصورت دست نخورده از دستگاه گوارش حیوانات تک معده اي عبور می کند. جهت تامین فسفر، جیره خوك و پرندگان باید با فسفات غیرآلی مکمل شود درحالیکه فسفر فیتاته بصورت کود حیوانی دفع می شود که در اتروفیکاسیون آبهاي سطحی نقش دارد - . - 12 قابلیت دسترسی فسفر فیتاته در دستگاه گوارش پرنده بسیار متغیر است - . - 5
مطالعات نشان داده که طیور به طور متوسط حدود 33 در صد فسفر موجود در جیره را مورد استفاده قرار می دهند و به دلیل فقدان فیتاز آندوژنوس توانایی کافی جهت هضم موثر فیتات گیاهی را ندارند و در نتیجه مقدار زیادي از فسفر به صورت دفعی ازدست می رود. - . - 11 بطور کلی قابلیت دسترسی فسفر فیتاته در طیور با محدوده اي از 0 تا % 50 به سن و انطباق سوخت و ساز بدن در شرایط بحرانی بستگی دارد . - 9 - از طرفی استفاده از مکمل خوراکی فسفربراي تامین احتیاجات غذایی حیوانات گران است و هزینه خوراك را در این حیوانات افزایش می دهد.
افزودن مکمل آنزیمی فیتاز به جیره طیور باعث بهبود پتانسیل بازده خوراك و نرخ رشد حیوانات و کاهش آلودگی محیط زیست می گردد . - 13 - آنزیمهاي فیتاز در بسیاري از گیاهان و میکروارگانیسم ها، به خصوص قارچ ها وجود دارند . - 3 - بهترین فیتازي که تا کنون شناخته شده از آسپرژیلوس فاسیوم است - 10 - .در طول چند سال گذشته استفاده از فیتاز میکروبی در جیره طیور به منظور بهبود قابلیت دسترسی به فسفر فیتاته رواج پیدا کرده و در این بین آنزیم فیتاز با منشاء ایکولاي بیشتر از همه انواع دیگر استفاده می شود؛ بطوریکه نسل جدیدي از آنزیم را معرفی کرده است.
نشخوارکنندگان برخلاف تک معده ايها در نتیجه همزیستی با باکتري ها قابلیت استفاده از فسفر فیتاته موجود در علوفه، دانه هاي غلات و لگومینه ها را دارند. از اینرو باکتریهاي شکمبه تا حد زیادي فعالیت فیتازي دارند . - 3 - فعالیت فیتازي باکتري هاي شکمبه بیش از 50 سال است که گزارش شده است. هدف از انجام این پژوهش جداسازي باکتري ها از شکمبه نشخوارکنندگان و بررسی کنتیک آنزیم فیتاز تولید شده از این باکتري ها به منظور استفاده در جیره طیور می باشد.
مواد و روش
کشت باکتري جداسازي باکتري ها از مایع شکمبه گاو نر نژاد هولشتاین با جیره اي شامل 60 درصد علوفه و 40 درصد کنسانتره انجام گرفت. به این منظور مایع شکمبه تازه پس از جمع آوري صاف شد و رقت هاي سریال از آن ساخته شد سپس کشت بی هوازي باکتري ها با استفاده از تکنیک برایانت و بارکی - 1953 - انجام گرفت. از آنجا که اکثر باکتري هایی که داراي فعالیت فیتازي هستند در گروه باکتري هاي پرتئولتیک و آمیلولتیک قرار دارند از این رو از محیط کشت ابوآکادا و بلاك بورن - 1963 - براي رشد باکتریهاي پروتئولتیک و از محیط کشت کوريهارا و همکاران - - 1968 براي رشد باکتر هاي آمیلولتیک استفاده شد.
به منظور سنجش فعالیت فیتازي باکتري ها جدا سازي شده از محیط هاي آمیلولتیک و پروتئولتیک، این باکتري ها در محیط کشت عمومی که حاوي 0/5 درصد سدیم فیتات بود کشت شدند. بعد از 24 ساعت کلنی هاي رشد کرده و سپس کلنیهاي موجود روي محیط کشت را شسته و سطح پلیت با محلول کلرید کبالت %2 پوشانده شد. بعد از 5 دقیقه انکوباسیون در دماي اتاق محلول کلرید کبالت با محلول تازه ساخته شده آمونیوم مولیبدات و آمونیوم وانادات - محلول حاوي % 6/25 آمونیوم مولیبدات و%0/42 آمونیوم وانادات - جایگزین شد. بعد از 5 دقیقه انکوباسیون در دماي اتاق، محلول از سطح پلیت ها برداشته شد و ناحیه شفاف روي پلیت مورد بازنگري قرار گرفت که نشان دهنده فعالیت فیتازي کلنی استقرار یافته بود.
کنتیک آنزیمی در محلول رویی هر کدام از باکتري هاي شناسایی شده تعیین شد. براي این منظور فعالیت آنزیمی این باکتريها مطابق روش یین و همکاران - 2007 - انجام گرفت. pH ایده آل براي فعالیت آنزیم فیتاز با تعیین میزان فعالیت در pH هاي3/5 ، 4/5 و 5/5 در بافر گلایسین تعیین شد. فعالیت یک واحد آنزیمی برابر یک میکرو مول در دقیقه تعریف شد. آزمون t براي مقایسه جفتی با تیمار شاهد - E.coli - براي هر نمونه جداسازي شده انجام شد.
نتایج و بحث
تعداد 40 سویه ازباکتریهاي شکمبه پس از کشت در محیطهاي آمیلولتیک و پرتئولتیک جدا سازي شدند. باکتریهاي تولیدکننده آنزیم فیتاز با تجزیه سدیم فیتات محیط کشت عمومی، هاله شفاف در اطراف کلنیها ایجاد کردند. بر اساس هاله شفاف تعداد 22 باکتري انتخاب شد. فعالیت فیتازي 6 گونه باکتري که بیشترین فعالیت را نشان دادند براي اندازه گیري کنتیک آنزیمی انتخاب شدند. فعالیت این باکتري ها طبق جدول 1 قابل مشاهده است. فعالیت یک واحد آنزیمی برابر یک میکرو مول در دقیقه تعریف شد.
نتایج جدول 1 نشان می دهد که فعالیت فیتازي باکتري هاي جدا شده از شکمبه از فعالیت فیتاز ایکولاي بیشتر بود. فعالیت فیتاز ایکولاي در فضاي پري پلاسمیدي حداکثر 50 واحد در میلیگرم بود . - 8 - بیان آنزیم ایکولاي در باکتري هاي دستکاري ژنتیکی شده به 80 واحد در میلیگرم هم می رسد . - 2 - همچنین فعالیت فیتازي در باکتري کلبسیلا شده از خاك در سویه اکسیتوکا MO-3 جدا شده از خاك مشاهده شده است. . - 7 -
فعالیت آنزیم بدست آمده از 6 گونه انتخاب شده در pH هاي مختلف نشان میدهد که با افزایش pH از 3/5 به 5/5 در اکثر باکتریهاي انتخاب شده فعالیت آنزیمی افزایش می یابد اما دربرخی سویه ها در 4/5pHفعالیت آنزیمی کمی بیشتر از 5/5pH میباشد. مطالعات نشان می دهد که اغلب باکتریهاي داراي فعالیت فیتازي، دماي مطلوب فعالیت مشابه قارچ - 50 تا 60 درجه سانتی گراد - دارند . اما در طیف وسیعتري از pH فعالیت بهینه بین 4 - تا - 7/5 دارند . - 14 -
از ویژگی هاي بیولوژیکی مهم براي یک فیتاز ایده ال می توان به تاثیر آن در آزاد سازي فسفر در دستگاه گوارش ، غیر فعال نشدن در برابر حرارت در فرایند فراوري خوراك و هزینه کم تولید آن اشاره نمود . با توجه به این ویژگی ها، تولید صنعتی آنزیم فیتاز تنها با استفاده از میکروارگانیسم ها مقرون به صرفه می باشد . - 4 - از آنجا که میکروارگانیسم هاي شکمبه با تولید منابع فراوان فیتاز قادر به تامین نیازهاي فسفر معدنی خوداز فیتات میباشند، به نظر میرسد که اکثر فیتاز تولیدشده در شکمبه از منشاء باکتریایی است . - 1 - از آن جهت که شکمبه یکی از منابع غنی گونه هاي باکتریایی با فعالیت ها ي بالقوه آنزیمی است می توان از این سویه ها براي تولید آنزیم استفاده کرد. در خصوص پروبیوتیک بودن باکتري هاي مورد آزمایش و اینکه آیا قادر به لانه گزینی و رشد و ورود به بدن طیور هستند مواردي است که جزء اهداف این آزمایش نبوده است.
